一、丝裂原活化蛋白激酶通路在髁突软骨细胞力学信号转导过程中的作用（论文文献综述）
王宝剑[1]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中进行了进一步梳理黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
周海玲[2]（2021）在《关节盘及关节囊中过表达Fgf8抑制颞下颌关节腔化的机制研究》文中进行了进一步梳理背景:颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）是人体使用最频繁的关节,参与言语、咀嚼、吞咽等生理功能。关节腔化是TMJ发育过程的重要步骤之一,关节腔发生纤维性粘连或骨粘连可导致TMJ强直。TMJ各组分之间的发育过程并非完全独立,各组分之间存在相互作用,其中关节盘及关节囊对于形成正常的关节腔及行使关节功能尤为重要,但其发育调控机制仍知之甚少。已有研究证明FGF8参与颌面部骨骼发育,颅神经嵴间充质中持续激活Fgf8可以抑制颌面部多种器官发育。本研究中,我们利用Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠,探究特异性激活Fgf8对小鼠TMJ发育及关节腔化过程的影响。目的:本研究利用Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠模型,即在Osr2-cre表达位置（TMJ关节盘、关节囊及韧带）中特异性激活Fgf8,进而探究Fgf8通过何种机制抑制关节盘及关节囊分化从而影响TMJ的发育。方法:本研究将Osr2-cre KI与Rosa26R-Fgf8小鼠交配获得Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠,取野生型（Wild Type,WT）和Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠胚胎进行固定、脱水、包埋及连续切片。茜素红（骨）/阿尔新蓝（软骨）染色法观察小鼠TMJ大体结构及髁突发育。Masson染色法观察TMJ发育的变化。将Osr2-cre;Rosa26R-m T/m G小鼠与Rosa26R-Fgf8小鼠交配,分别获得Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;m T/m G小鼠及Osr2-cre;Rosa26R-m T/m G小鼠,将Osr2-cre;m T/m G、Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;m T/m G小鼠胚胎进行冰冻切片及荧光显微镜下拍照观察Osr2-cre（绿色荧光）的表达模式。Brd U、TUNEL法标记法检测小鼠TMJ组织的细胞增殖与凋亡情况。天狼猩红染色法检测小鼠TMJ关节囊及关节盘的胶原排列情况。阿尔新蓝染色观察小鼠TMJ中糖基化差异。IHC法检测小鼠TMJ相关组织中Sox9、p-Erk1/2、Fgfr1等蛋白水平变化及分布情况。结果:（1）茜素红（骨）/阿尔新蓝（软骨）染色显示,与WT相比E16.5及P0Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠TMJ开口度大且髁突尺寸减小,提示Fgf8激活可能会抑制小鼠TMJ髁突发育。（2）Masson染色显示,Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠的髁突形态发育异常且尺寸变小,关节盘、关节囊及韧带未正常形成,导致关节未正常腔化。（3）通过Rosa26R-m T/m G红绿双荧光报告小鼠来检测Osr2-cre在TMJ发育过程中的表达模式,Osr2-cre;m T/m G（WT）在TMJ的关节盘、关节囊及韧带特异性激活Osr2-cre（绿色荧光）,而Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8;Rosa26R-m T/m G小鼠关节盘关节囊绿色荧光范围较WT更弥散。（4）Brd U标记结果显示,与WT相比,E15.5及E16.5Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠关节囊及关节腔的区域细胞增殖水平增高,TUNEL法检测E15.5及E16.5 Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠TMJ中细胞凋亡无明显差别,提示Fgf8激活能够促进关节囊及关节盘细胞增殖。（5）苦味酸-天狼猩红染色显示,与WT相比,E18.5 Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠关节囊出现胶原排列紊乱,提示Fgf8激活能够促进关节囊及关节盘出现纤维化。（6）阿尔新蓝染色显示,与WT相比,E16.5 Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠关节盘及关节囊着色范围、强度均增高,提示随着Fgf8激活,TMJ关节盘及关节囊中糖胺聚糖积累明显增加;免疫组化染色显示,与WT相比Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠,E17.5Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠TMJ关节盘及关节囊处Sox9活性增强,以上结果提示Fgf8激活能够促进关节囊及关节盘软骨化生。（7）免疫组化染色显示,与WT相比E15.5 Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠Fgfr1和p-Erk1/2在关节盘及关节囊水平异常激活,提示Fgf8通过激活Fgfr1/Erk信号抑制关节盘及关节囊分化。结论:（1）Fgf8激活能够促进TMJ关节盘和关节囊前体细胞的增殖及Sox9表达,从而导致关节盘、关节囊出现软骨化;（2）Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠出现TMJ腔化失败表型,具体表现为关节囊、关节盘未形成时,关节腔也不能形成,说明关节腔的形成需要关节盘和关节囊的相互作用;（3）Osr2-cre;Rosa26R-Fgf8小鼠TMJ中FGF/ERK信号传导被增强,导致关节囊及关节盘前体细胞维持在软骨细胞状态。
周晓红[3]（2021）在《从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究》文中研究指明目的探讨从肝论治针灸对改良Hulth法制备的内侧间室OA模型大鼠软骨组织的影响,初步阐明从肝论治针灸防治OA模型大鼠软骨组织损伤的效应及昼夜节律作用机制,以期为从肝论治防治OA提供科学实验依据。方法实验一选用30只12周龄SPF级雄性SD大鼠,随机分为模型组、假手术组、正常组,每组10只。模型组,采用改良Hulth法,切开右膝关节前内侧皮肤,钝性分离,暴露股骨内侧髁及关节囊,依次切断内侧副韧带和前交叉韧带,剔除内侧半月板,假手术组仅切开并暴露股骨内侧髁及关节囊,而正常组未予任何手术处理。术后1周,将大鼠放入跑台运动装置每天跑30min,持续3周以复制OA模型。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测,影象学检查右膝关节,关节液中TNF-α、IL-1β含量使用免疫酶联ELISA法检测,软骨损伤情况使用关节标本HE染色及Mankin评分观察,软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。实验二将40只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为正常组、从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组。其中正常组不做处理,另3组均予造模。治疗从造模手术后4周开始（即跑台3周结束后开始治疗）,共治疗4周。从肝论治取穴组取阳陵泉、肝俞、太冲,常规取穴组取足三里、外膝眼、内膝眼。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测,关节液中IL-1β、TNF-α含量使用免疫酶联ELISA法检测,关节软骨损伤情况使用标本HE染色及Mankin评分观察,软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。实验三将50只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为5组。各组处理如下:1)正常组:不手术,不治疗。2)模型组:仅造模,不治疗。3)ERK抑制剂组:造模,手术4周后腹腔注射ERK抑制剂,连续注射28天。4)从肝论治取穴组:造模,手术4周后针灸治疗,从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。5)ERK抑制剂+从肝论治取穴组:造模,手术4周后腹腔注射ERK抑制剂,连续注射28天,同时进行针灸治疗,从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。治疗结束后,关节标本HE染色及Mankin评分观察软骨损伤情况,免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α含量,并通过免疫荧光法和免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白含量。结果实验一1.大鼠术后第1周,与正常组相比,模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小,休息时间延长（P<0.01）,假手术组仅活动速度、机械痛阈值、热痛阈值减小（P<0.01）,而活动总距离、休息时间、关节活动度差异无统计学意义（P>0.05）,与模型组相比,假手术组活动总距离、活动速度、关节活动度增加,休息时间减少（P<0.01）;术后第2-4周,与正常组相比,模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小,休息时间延长（P<0.01）,而假手术组旷场实验、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度差异无统计学意义（P>0.05）。2.大鼠膝关节炎影象学检查显示,正常组和假手术组:右膝关节可见关节间隙存在,且内外侧间隙均匀一致,未见明显骨赘及骨破损。模型组:右膝关节可见关节间隙变窄,且内侧间隙小于外侧,有明显骨赘形成。3.软骨标本HE染色显示,与正常组相比,模型组Markin评分明显升高（P<0.01）,假手术组Markin评分差异无统计学意义（p>0.05）。4.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示,与正常组相比,假手术组IL-1β、TNF-α的含量差异不明显（P>0.05）,模型组IL-1β、TNF-α的含量明显增多（P<0.01）。5.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠膝关节软骨组织显示,与正常组相比,模型组Bmal1,Clock蛋白的表达明显下降（P<0.01）,而假手术组Bmal1,Clock蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。实验二1.大鼠术后1周,与正常组相比,其他各组旷场实验、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度有显着性差异（P<0.05）,但造模组间差异无统计学意义（P>0.05）;术后第2-4周,与正常组相比,其他各组大鼠活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度减小（P<0.05）,休息时间明显延长（P<0.05）,但造模组间差异无统计学意义（P>0.05）;大鼠术后第5-8周,与正常组相比,其他各组活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度明显降低（P<0.05）,休息时间明显延长（P<0.05）,与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度,并减少休息时间（P<0.05）,且从第6周开始常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠运动速度（P<0.05）,与常规取穴组相比,从肝论治取穴组明能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度,并减少休息时间（P<0.05）,且从第7周开始从肝论治取穴组能明显提高大鼠活动速度（P<0.05）。2.软骨标本HE染色显示,与正常组比,其他各组Markin评分均增高（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组Marki n评分均明显降低（P<0.01）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组M arkin评分稍低,但差异无统计学意义（P>0.05）。3.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示,与正常组相比,其他组TNF-α、IL-1β的含量增多（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量明显减少（P<0.05）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）。4.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示,与正常组相比,其他各组Bmal1、Clock蛋白含量均下降（P<0.01）;与模型组相比,常规取穴组和从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高（P<0.01）;与常规取穴组相比,从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高（P<0.05）。实验三1.软骨标本HE染色显示,从Markin评分来看,与正常组比,其他组均明显增高（P<0.001）;与模型组相比,从肝论治取穴组、ERK抑制剂组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组均明显降低（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组Markin’s评分差异无统计学意义（p>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低（p<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低（p<0.05）。2.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液中IL-1β、TNF-α的含量显示,与正常组比,其他组明显升高（P<0.01）;与模型组相比,ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组明显减少（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组差异无统计学意义（P>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少（P<0.05）。3.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示,与正常组相比,其他各组Bmal1、Clock蛋白表达量均下降（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显增多（P<0.05）;与模型组相比,ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组大鼠膝关节软骨组织中Bmal1、Clock蛋白表达量均增多（P<0.01）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量均明显减少（P<0.01）;与ERK抑制剂组相比,从肝论治取穴组Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05）,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量增多（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量减少（P<0.05）;与从肝论治取穴组相比,ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量较高（P<0.05）,P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显减少（P<0.05）。结论1.采用改良Hulth法造模可以有效复制内侧间室OA模型,且模型昼夜节律蛋白存在异常。2.从肝论治针灸治疗内侧间室OA效果优于常规取穴针灸。3.从肝论治针灸可以改善内侧间室OA关节功能,修复损伤软骨,可能与昼夜节律蛋白抑制ERK1/2的磷酸化,减少炎症物质产生、减少软骨基质破坏有关。
贾梦莹[4]（2021）在《NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用》文中进行了进一步梳理目的:颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular Joint Osteoarthritis,TMJOA）是影响口颌功能的颌面部高发病,髁突软骨缺损难以自愈,其退变分子机制不明。力学刺激直接作用软骨,炎症反应广泛参与髁突软骨破坏。细胞焦亡以释放炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β）,IL-18为主要特征,参与慢性炎症,而细胞焦亡在TMJOA软骨细胞中的研究甚少。为此本研究旨在探索异常力学刺激下NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在软骨细胞的表达情况,为TMJOA的靶向治疗提供线索。方法:第一部分:（1）临床研究,收集就诊于新疆医科大学第一附属医院颞下颌关节紊乱病患者颞下颌关节滑液,根据CBCT或MRI检查分为伴髁突骨质破坏的TMJOA患者组与不伴髁突骨质破坏的颞下颌关节结构紊乱病（Temporomandibular Joint internal derangement,TMJID）组,分析临床基线资料。（2）酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3在两组的表达差异。第二部分:（1）组织水平,通过SD大鼠单侧前牙反牙合（Unilateral anterior crossbite,UAC）干预4周,8周,12周,建立TMJOA模型,通过体式显微镜观察软骨形态结构,Micro-CT扫描软骨下骨,Mimics 20.0系统分析骨体积分数BV/TV,骨表面积与骨体积比BS/TV,骨小梁厚度Tb.Th及骨小梁个数Tb.N,评价软骨下骨改建情况,组织病理学检查及评分系统评价软骨病损特征。（2）使用免疫组织化学技术检测焦亡经典途径关键分子IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在正常组与UAC诱导组颞下颌关节组织的表达及分布,实时聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）以及蛋白印迹法（Western blot,WB）检测焦亡关键基因及蛋白在UAC诱导组与对照组的表达情况。第三部分:（1）分子水平,分离培养SD大鼠软骨细胞,分别采用0 dyn/cm2,4 dyn/cm2,12dyn/cm2,16 dyn/cm2的流体剪切力（Fluid Flow Shear Stress,FFSS）干预软骨细胞1h;采用12 dyn/cm2的FFSS干预软骨细胞1h,2h,4h,通过ELISA技术比较软骨细胞培养基上清液中IL-18,IL-1β的表达差异。（2）通过AO-EB染色比较细胞破膜死亡在各组的表达情况。（3）通过WB技术比较焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在各组的表达差异。结果:第一部分:（1）伴髁突骨质破坏的TMJOA患者与不伴有髁突骨质破坏的TMJID患者好于发中青年女性,均有颞下颌关节疼痛及功能紊乱症状,TMJOA组功能紊乱人数占比较大。（2）颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的表达比较分析,证明了伴髁突骨质破坏的TMJOA患者IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的浓度较高（P<0.05）。第二部分:（1）UAC可诱导TMJOA样表现,体式显微镜可见软骨形变,随UAC作用时间延长,较同时间正常对照组病损加重,Micro-CT显示BV/TV较同时间正常对照组降低,软骨下骨丧失明显,UAC诱导4周出现BS/BV增高（P<0.05）,短期骨改建,UAC诱导8周及12周,差异无统计学意义（P<0.05）,Tb.Th在UAC诱导12周减小,Tb.N在UAC诱导4周,8周减小（P<0.05）。UAC诱导组较同时间正常对照组组织病理学评分增加。（2）免疫组化显示UAC组焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD高表达于软骨层,RT-PCR及WB亦检测到UAC诱导组较同时间正常对照组表达高水平的焦亡相关基因及蛋白（P<0.05）。第三部分:（1）ELISA结果表明软骨均接受1h FFSS干预时,4 dyn/cm2,12 dyn/cm2,16 dyn/cm2FFSS干预组较0 dyn/cm2FFSS对照组比较,培养基上清炎性因子IL-1β,IL-18的表达水平增高（P<0.05）。在12dyn/cm2FFSS作用下,随FFSS干预时间延长,软骨细胞焦亡关键分子表达增高（P<0.05）。（2）AO-EB染色表明随FFSS载荷的增加以及作用时间的延长,破膜死亡细胞数增多。（3）WB显示软骨细胞焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD的表达也随FFSS载荷增加以及作用时间的延长而上调（P<0.05）。结论:（1）TMJOA患者滑液中可表达高浓度的焦亡相关炎性介质。（2）单侧前牙反牙合可诱导TMJOA病损,焦亡关键蛋白可表达于髁突软骨层,随OA病损程度加重,焦亡关键分子基因及蛋白的表达量增加。（3）软骨细胞存在细胞焦亡,随FFSS作用软骨细胞强度及时间的增加,软骨细胞焦亡现象加重。
陈国昆[5]（2020）在《节律基因Bmal1通过调控MAPK/ERK信号通路介导颞下颌骨关节炎的机制研究》文中研究表明目的:颞下颌骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ-OA）是最常见的关节退行性疾病。TMJ-OA在存在精神和心理等方面的诱发因素作用下,当发生咬合创伤时更为好发。本课题目的是探讨慢性睡眠节律紊乱（circadian rhythm disturbance,CRD）与TMJ-OA的关系,在睡眠节律紊乱状态下,节律基因Bmal1和MAPK/ERK信号通路及其下游相关转录因子的表达变化,及其导致细胞外基质降解及关节炎症进行发展的机制,明确时钟节律基因Bmal1通过调控MAPK/ERK信号通路介导的颞下颌骨关节炎的机制。方法:检测大鼠时钟节律基因Bmal1的昼夜表达节律后,选择合适时间段采用实验用改良多平台模型（Modified multiple platform method,MMPM）干扰大鼠的正常睡眠节律。测定Wistar大鼠血清中的皮质醇（Cortisol,CORT）和促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone,ACTH）的激素水平,评估大鼠慢性睡眠节律紊乱模型建立的效果。HE染色法观察大鼠TMJ髁突软骨的破坏程度。采用免疫组织化学、Western blot和RT-qPCR观察时钟节律基因Bmal1,MAPK/ERK信号通路及关节炎症性因子IL-6在睡眠节律紊乱状态的大鼠髁突软骨中的表达变化。体外分离培养大鼠髁突软骨细胞（Mandibular condylar chondrocytes,MCCs）,使用炎症因子白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）诱导MCCs的炎性状态后,分别使用ERK特异性抑制U0126、Bmal1-siRNA和Bmal1-plasmid分组加入到体外TMJ-OA模型的软骨细胞培养基中。通过阿利新蓝染色法观察软骨细胞的形态特征,通过CCK-8检测软骨细胞的生长增殖状态,并通过Western blot观察时钟节律基因Bmal1,MAPK/ERK信号通路及下游的基质金属蛋白酶和细胞外基质的表达变化。明确时钟节律基因Bmal1通过调控MAPK/ERK信号通路介导的颞下颌骨关节炎的机制。再次通过给睡眠节律紊乱状态下的大鼠关节腔内注射含Bmal1过表达质粒的腺病毒,使用Western blot和RT-qPCR观察时钟节律基因Bmal1,MAPK/ERK信号通路及下游的基质金属蛋白酶和细胞外基质的表达变化,在体内进一步验证时钟节律基因Bmal1对于睡眠节律紊乱状态下的颞下颌骨关节的影响。结果:我们采用MMPM干扰大鼠正常睡眠节律后,成功的导致大鼠进入睡眠节律紊乱的应激状态。血清学结果显示:随着睡眠节律紊乱时间的延长,睡眠节律紊乱组（Circadian rhythm disturbance,CRD）和恢复组（Circadian rhythm recovery,REC）与对照组（Control,CON）的各亚组进行比较,大鼠的血清中CORT和ACTH的含量显着上升（p<0.05）。HE染色结果显示:保持正常昼夜节律CON组的大鼠髁突软骨结构正常,而CRD组和REC组的大鼠髁突软骨出现损害并表现出病理学改变。且随着睡眠节律紊乱时间的延长破坏加重。免疫组化、Western blot和RT-qPCR结果显示:与CON组对比,CRD和REC组的IL-6和p-ERK均表达均增高。且随着睡眠节律紊乱的时间延长升高。当停止睡眠节律干扰并调整至正常的昼夜节律后,IL-6和p-ERK的表达降低。而时钟节律基因Bmll经过睡眠节律干扰后,在CRD和REC组中的表达较CON组均降低。当停止进行睡眠节律干扰并调整至正常的昼夜节律后,Bmal1的表达上调。体外成功分离并培养大鼠MCCs,并用IL-6诱导MCCs的炎性状态。使用U0126抑制ERK的磷酸化后,Western结果显示下游的MMP3、MMP13和ADAMTS5表达下调,Col2α1表达上调,而时钟节律基因Bmal1的表达差异无统计学意义（p>0.05）。阿利新蓝染色的结果显示,在炎症状态下使用U0126后硫酸软骨素分泌增多。CCK-8结果显示炎症状态下细胞增殖速率下降,使用U0126后增殖速率提高。使用Bmal1-siRNA后,Western结果显示p-ERK、MMP3,MMP13和ADAMTS5表达上调,Col2α1表达下调,而使用Bmal1-plasmid后结果相反。同时阿利新蓝染色结果显示在炎症状态下,使用Bmal1-siRNA后硫酸软骨素分泌减少,使用Bmal1-plasmid后分泌增多。CCK-8结果显示炎症状态下加入Bmal1-siRNA后细胞增殖速率进一步降低,而加入Bmal1-plasmid后细胞增殖速率提高。给睡眠节律紊乱状态下的大鼠关节腔内注射含Bmal1过表达质粒的腺病毒,Western blot和RT-qPCR结果显示,注射组和对照组组相比p-ERK、MMP3、MMP13和ADAMTS5表达下调,而COL2α1的表达上调。结论:当睡眠节律紊乱状态下,时钟节律基因Bmal1表达失调,导致MAPK/ERK信号通路被激活,ERK的磷酸化水平逐渐升高,同时与关节炎症的发展密切相关的炎症性因子IL-6和软骨细胞外基质降解相关的酶类MMP3、MMP13和ADAMTS5表达水平升高。而与细胞外间质结构的完整性相关的COL2α1表达下调,继而髁突产生炎症病理性改变。本研究通过探索睡眠节律紊乱状态对OA软骨退变的调控作用机理,解释了时钟节律基因Bmall在睡眠节律紊乱状态下骨关节炎发病过程中的重要作用。为今后“脑-关节轴”（brain-joint axis）相关的OA病理生理学研究奠定了基础。
刘陆[6]（2020）在《乌头注射液对兔膝骨关节炎软骨细胞JNK表达的影响》文中认为目的:通过实验数据分析乌头注射液对兔膝骨性关节炎软骨细胞中JNK表达的影响,证明乌头注射液对膝关节骨性关节炎存在良好的治疗作用。方法:1、将32只新西兰大耳兔随机分为两组:空白组和造模组,空白组（A）7只,造模组25只。对造模组进行造模:用戊巴比妥钠（30mg/kg）进行麻醉后,将预先配置好的2%w/v木瓜蛋白酶和0.03mol/L L-半胱氨酸混合溶液注入兔膝关节腔内,给药时间为第1,3,5天,给药剂量以0.1ml/kg为标准,给药完毕后在相同环境中饲养2周。从空白组和造模组中各随机挑选一只大耳兔进行解剖,以确定造模成功。再将造模组24只大耳兔随机分为模型组（B）、玻璃酸钠对照组（C）、正清风痛宁对照组（D）和乌头注射液治疗组（E）,每组6只。2、造模成功后的第1、4、7、10天分别向兔双后膝关节腔注射实验试剂,玻璃酸钠组给予玻璃酸钠注射液0.2ml,正清风痛宁组给予正清风痛宁注射液0.2ml,乌头注射液组给予乌头注射液0.2ml,模型组给予生理盐水0.2ml,空白组不给予任何处理。给药完毕后继续饲养1周,以空气栓塞法逐一处死实验白兔,充分暴露各组兔右后膝关节的关节软骨,肉眼观察软骨情况,并记录;最后采集关节软骨:取膝关节胫骨平台软骨及软骨下组织置于液氮中保存。3、肉眼观察各组关节软骨外观,镜下组织病理学对比关节软骨细胞的变化,以免疫组化法检测软骨细胞中JNK的表达,实验数据采用SPSS19.0进行处理,计量资料以（x±s）表示,多组间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,P<0.05表示有统计学意义。结果:1、肉眼观可见,模型组较空白组关节软骨破坏明显,乌头注射液组、玻璃酸钠组和正清风痛宁组与模型组比较,关节软骨表面无明显缺损及裂纹,软骨边缘赘生骨赘少,关节软骨较完整,且乌头注射液组明显优于对照组。2、HE染色法显示,模型组关节软骨细胞较空白组凋亡明显,乌头注射液组、玻璃酸钠组和正清风痛宁组与模型组相比,软骨细胞大致正常,偶见有白泡样的凋亡细胞,细胞的集簇,层叠现象很少,核分叶与核固缩现象亦不明显,且乌头注射液组优于对照组。3、免疫组化结果显示,模型组软骨细胞JNK表达量明显高于空白组,组间差异有统计学意义（P<0.05）,乌头注射液组、玻璃酸钠组和正清风痛宁组软骨细胞JNK表达量明显低于模型组,组间差异有统计学意义（P<0.05）,乌头注射液组与对照组JNK表达量差异不明显,无统计学意义（P>0.05）。结论:乌头注射液抑制了关节软骨细胞JNK的表达,保护了关节软骨,对KOA有显着的治疗作用,该机制的发生可能与MAPK/JNK信号通路被阻断有关。
刘美希[7]（2020）在《Wnt/β-catenin信号通路在功能矫形力过载致大鼠TMJ OA中的作用》文中认为研究目的:临床上,针对以骨性下颌后缩为主要特征的安氏Ⅱ类错牙合畸形的患者,通常将功能矫形作为此类疾病的早期矫治方法。患者通过戴用功能矫治器,改变髁突在关节窝中的位置,以刺激下颌体以及下颌升支的生长。然而若功能矫形力过大,超过了髁突适应性改建的能力,颞下颌关节就会出现不适的状况,严重者会出现颞下颌关节骨关节炎（TMJ OA）。根据现有的文献记载,颞下颌关节骨关节炎的病因和它的发病机制仍不明了。以往对颞下颌关节骨关节炎的研究在软骨下骨方面的报道相对较少,更多是集中在髁突软骨的改变及其与骨关节炎的关系上。很多实验报道,在维持骨细胞和成骨细胞日常功能方面,Wnt/β-catenin信号通路起关键作用。本实验旨在研究Wnt/β-catenin信号通路在功能矫形力过载所致TMJ OA的作用及机制,了解Wnt/β-catenin信号通路相关因子在功能矫形力过载的髁突中软骨及软骨下骨的表达,并为进一步有效的临床防治此类疾病提供更完善的理论支持。研究方法:1、首先建立大鼠下颌前伸模型,然后在模型成功建立后的三个时间点,即2周、4周和8周收集大鼠髁突软骨标本。采用TRAP染色、番红O/固绿（SO）染色、苏木精/伊红（HE）染色和Micro-CT观察大鼠颞下颌关节髁突软骨以及软骨下骨的变化;采用免疫组织化学（IHC）检测软骨下骨Wnt/β-catenin信号通路相关因子β-catenin、TCF-4、sclerostin以及骨保护素OPG及其配体RANKL的变化和阳性细胞百分数的变化,2、将DKK1注射于大鼠颞下颌关节腔,抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,再次检测大鼠关节软骨及软骨下骨的变化及上述蛋白的表达变化。用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析,了解各因子在各组中的表达差异。研究结果:1、HE染色显示:与同期对照组相比,2周、4周和8周实验组的大鼠髁突发生退行性变,软骨下骨的骨小梁排列紊乱,软骨细胞的密度减小,且随时间的延长,各组的变化趋势越来越严重。番红O/固绿染色显示:8周实验组大鼠髁突软骨中软骨基质丢失较2周实验组和4周实验组更为严重。实验注射组（Exp+DKK1）软骨破环程度较同期（Exp+NS）组轻,对照注射组（Con+DKK1）与同期（Con+NS）相比无明显变化。2、Micro CT显示:与同期的对照组相比较,实验组髁突软骨下骨骨小梁厚度（Tb.Th）,骨小梁数量（Tb.N）,相对骨体积分数（BV/TV）,骨密度（BMD）明显减少,随时间延长骨质破坏更多。不同时间点实验注射组（Exp+DKK1）大鼠TMJ髁突软骨下骨骨密度（BMD）,相对骨体积分数（BV/TV）,骨小梁厚度（Tb.Th）与实验组（Exp+NS）相比明显降低;4周和8周实验注射组（Exp+DKK1）骨小梁数量（Tb.N）明显低于（Exp+NS）骨小梁数量（Tb.N）（P<0.05）。3、免疫组化显示:与同期的对照组相比较,2周、4周和8周实验组中β-catenin、TCF-4和RANKL的阳性细胞百分数增加,sclerostin阳性细胞百分数较空白对照组降低（P<0.05）。实验注射组（Exp+DKK1）中的β-catenin、TCF-4、RANKL蛋白表达较同期实验组（Exp+NS）降低（P<0.05）。研究结论:Wnt/β-catenin信号通路能够在功能矫形力过载所致TMJ OA病程的调控中发挥关键的作用。尽管目前尚不清楚骨关节炎的病因和性质,但通过对大鼠下颌的髁突软骨和髁突软骨下骨的形态学观察,探求Wnt/β-catenin信号通路在功能矫形力过载的髁突中的作用机制,可为有效防治TMJ OA增添新的治疗方法。
朱云森[8]（2020）在《骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究》文中研究指明背景和目的:正常的骨基质矿化是骨形成和骨修复重建的关键步骤;成骨细胞分泌的I型胶原组成基质的主要成分并提供矿化的基础框架结构,而非胶原蛋白参与并调控羟基磷灰石的有序沉积。骨粘连蛋白（osteonectin,ON）是一种重要的非胶原蛋白,又称为SPARC或BM-40,它对1型胶原和羟基磷灰石有高度的亲和力,参与了细胞外基质矿化的始末过程;同时作为重要的细胞外基质功能调节蛋白,骨粘连蛋白调节细胞外基质和胶原的合成,影响成骨细胞数量和功能,对矿化起重要的调控作用。P38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶,是细胞外信号向细胞内传导的重要通路,也是骨形成的重要信号枢纽,在不同的成骨信号的作用下,p38MAPK可以调节成骨细胞碱性磷酸酶的活性和矿化能力。既往骨粘连蛋白在矿化中的研究多集中于基因敲除的动物实验,本课题的目点是为骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化提供直接的实验依据,同时对p38 MAPK是否是其重要的信号传导途径进行实验研究,为有效干预骨基质矿化提供更多的作用位点。研究方法:第一部分:成骨细胞分离、培养与鉴定取新生SD乳鼠（出生48h内）的颅盖骨,采用酶交替消化法进行成骨细胞分离,利用差异贴壁法进行纯化,获得的成骨细胞使用碱性磷酸酶染色进行阳性率测定,茜素红染色检测矿化结节形成。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞矿化期OCN、OPN、BSP及p38 MAPK基因表达的影响研究分离培养获得的传代成骨细胞进行随机分组,分别加入不同浓度的大鼠重组骨粘连蛋白（SPARC/BM-40）:A组,空白对照组,不添加骨粘连蛋白;B组,0.01μg/ml骨粘连蛋白;C组,0.1μg/ml骨粘连蛋白;D组,1μg/ml骨粘连蛋白;E组,10μg/ml骨粘连蛋白;在第2、5及8d分别取材并提取各组RNA,通过RT-qPCR检测骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、骨涎蛋白（BSP）及p38 MAPK的基因表达,明确骨粘连蛋白在成骨细胞矿化中的调控作用,并根据实验结果确定实验的最佳适宜浓度（骨粘连蛋白OPTIMA）及取材观察时间。第三部分:骨粘连蛋白对成骨细胞其它矿化指标的影响及SB203580（p38MAPK特异性阻断剂）的阻断效应研究根据第二部分实验结果,我们对骨粘连蛋白在成骨细胞中的正向调控作用进行进一步证实,同时对p38的具体作用进行研究,实验进行重新分组:空白对照组,不添加骨粘连蛋白;骨粘连蛋白OPTIMA组,添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h,再添加骨粘连蛋白OPTIMA;实验增加了小整合素结合配体N-连接糖蛋白家族:细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）、牙本质基质蛋白1（DMP1）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达的RT-qPCR检测;同时利用流式细胞仪对成骨细胞内钙离子浓度进行了测定;茜素红染色检测矿化结节及电镜下观察成骨细胞的超微结构;Western-blot测定各组p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK（P-p38）的蛋白表达。第四部分:P38 MAPK重组腺病毒载体及p38 MAPK-shRNA慢病毒载体的构建P38MAPK重组腺病毒载体（AD-p38）的构建:根据基因库序列,设计p38MAPK引物,加入酶切位点,以大鼠心脏cDNA为模板进行PCR扩增,经过测序鉴定后,将目的基因片段连入pShuttle-CMV的相应酶切位点,构建重组腺病毒穿梭质粒,酶切线性化处理后将其与AdEasyTM DNA共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdEasyTM质粒制备Ad-p38MAPK DNA转染细胞。P38MAPK-shRNA慢病毒载体的构建:根据p38MAPK基因序列,由公司合成提供3条干扰靶点序列shRNA1、shRNA2、shRNA3及非特异性靶序列,经酶切线性化处理后,通过连结慢病毒穿梭质粒及辅助包装共转染细胞,进行病毒滴度测定,通过效应蛋白表达检测选择干扰程度最大的用于后续试验。第五部分:P38信号通路在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的作用的进一步研究为了进一步探讨p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的信号通路作用,我们通过构建的p38 MAPK重组腺病毒载体转染成骨细胞过表达p38及p38-shRNA慢病毒载体转染成骨细胞来抑制表达p38,并进行实验分组:对照组,仅添加骨粘连蛋白OPTIMA;AD-p38 MAPK组:成骨细胞被AD-p38 MAPK转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h再添加骨粘连蛋白OpTIMA;p38 MAPK-shRNA组:成骨细胞被p38 MAPK-shRNA转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;使用RT-qPCR和Western-blot法测定各组OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE及p38MAPK基因和蛋白的表达。结果:第一部分:分离培养的成骨细胞通过碱性磷酸酶染色细胞阳性率接近100%,矿化诱导2周后茜素红染色及四环素培养标记的矿化结节观察,结果满意。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及p38的基因表达均有不同程度的影响;根据实验结果确定1μg/ml骨粘连蛋白为本组实验最佳效应浓度（骨粘连蛋白OpTIMA）,第5天为实验观察取材时间;1μg/ml的骨粘连蛋白组在第5天能显着提高成骨细胞OCN、OPN、BSP及p38的基因表达,与空白对照组比较差异均有统计学差异（OCN,p<0.01;OPN,p<0.05;BSP,p<0.05;p38,p<0.001）;同时我们得出初步结论,骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用,并对p38 MAPK通路有激活作用。第三部分:实验进一步证实了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化中的正向调控作用,p38 MAPK是其重要的信号传导通路。P38 MAPK蛋白测定结果显示骨粘连蛋白OPTIMA组p38及P-p38的蛋白表达均明显增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义（p<0.001）;骨粘连蛋白OPTIMA组Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达与空白对照组比较均有明显提高,差异均有统计学意义（DMP1,p<0.01;DSPP,p<0.01;MEPE,p<0.001）;流式细胞仪进行细胞内钙离子浓度测定显示骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较明显提高,差异有统计学意义（p<0.01）;根据茜素红染色及photoshop成像分析,骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较矿化结节面积明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;电镜下超微结构观察与空白对照组比较,骨粘连蛋白OPTIMA组细胞成骨活性增加,成骨细胞内含有更多的细胞器及富含矿化物的囊泡结构。添加p38阻断剂（SB203580）后与骨粘连蛋白OPTIMA组比较,P-p38的蛋白测定有显着下降（P<0.001）,非胶原蛋白（OCN、OPN、BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达也均有明显下降,差异均有统计学意义,电镜下观察成骨细胞活性较骨粘连蛋白OPTIMA组明显受到抑制。第四部分:P38MAPK重组腺病毒载体构建中的基因片段电泳验证及序列测定结果均与基因库一致;p38MAPK-shRNA慢病毒载体通过干扰预实验选择p38MAPK-shRNA3转染成骨细胞（干预性能与对照组比较:shRNA1、shRNA2,P<0.01;shRNA3,P<0.001）,病毒滴度的测定阳性转染组为1.7×108IU/ml（对照组:2 × 108IU/ml）,符合实验标准。第五部分:实验进一步证实了 p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的重要作用;结果显示AD-p38组明显上调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因和蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均显着升高,两组差异均有统计学意义;而p38-shRNA组及p38阻断剂组明显下调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,两组的OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因、蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均明显下降,差异均有统计学意义。结论:骨粘连蛋白通过p38 MAPK通路调控成骨细胞矿化:①骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因和蛋白表达,显着提高细胞内钙离子浓度,促进成骨细胞矿化结节的形成和成骨活性。②骨粘连蛋白可以激活p38 MAPK信号通路:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞p38 MAPK的基因和蛋白表达。③P38MAPK是骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化的重要信号通路:p38阻断剂的使用及p38-shRNA病毒载体转染的成骨细胞（p38抑制表达）明显下调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用;AD-p38转染的成骨细胞（p38过表达）上调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用。
陈松[9]（2020）在《补肾益气方蠲痹胶囊对绝经后膝骨关炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路影响的研究》文中研究说明目的:观察蠲痹胶囊对绝经后膝骨关节炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路及其关键因子表达的影响,探讨蠲痹胶囊防治绝经后膝骨关节炎的可能作用机制。方法:（1）选取30只5月龄雌性未孕豚鼠,应用豚鼠自发造模方法建立原发性膝骨关节炎动物模型,采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化方法分离提取5月龄膝骨关节炎豚鼠模型成纤维样滑膜细胞（FLS）和软骨下成骨细胞（OB）,并对细胞进行体外培养、传代,通过倒置显微镜、HE染色观察细胞基本形态;通过免疫组化和免疫荧光CD44、CD55、Vinmentin、CD90、CD68对成纤维样滑膜细胞（FLS）进行细胞表面标记物鉴定;通过碱性磷酸酶染色（ALP）和茜素红染色完成软骨下成骨细胞（OB）的鉴定。（2）选取32只5月龄雌性膝骨关节炎模型豚鼠随机分为蠲痹胶囊组、西药组（双醋瑞因胶囊）、模型组、假手术组,在此基础上采用双侧卵巢切除法建立绝经后膝骨关节炎复合动物模型。蠲痹胶囊组动物给予蠲痹胶囊水溶液灌胃干预,西药组动物给予双醋瑞因胶囊水溶液灌胃干预,而模型组和假手术组动物给予等量纯水灌胃干预。灌胃结束后,腹主动脉采血法采血,制备蠲痹胶囊组、西药组（双醋瑞因胶囊）、模型组、假手术组的含药血清,筛选最适血清并用其干预成纤维样滑膜细胞（FLS）和软骨下成骨细胞（OB）。细胞干预结束后,收集保留各组细胞最后一天干预结束时培养孔中的细胞培养液,离心并保留上清液;Trizol法提取成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞内总RNA;增强型RIPA裂解液裂解细胞,提取成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞内总蛋白。Elisa法测定模型组和假手术组血清中雌激素含量以及含药血清干预后各组细胞上清液中TNF-α的含量;RT-PCR法检测细胞内TLR4、TRAF6基因表达水平;Western blot法检测细胞内NF-κBp65蛋白表达水平。使用Pathway Builder Tool、SPSS22.0、Graph Pad Prism 8.0.2、Image J软件实验作图、建立基础数据库、图片处理及统计学分析处理。结果:（1）原代成纤维样滑膜细胞（FLS）通过体外培养、传代可以将其进一步纯化,当培养到第三代时,FLS大多呈纺锤状、不规则梭形、多边形、类三角形、星形,旋涡状聚集分布生长,卵圆形的细胞核位于细胞中央,形态学上符合成纤维样滑膜细胞（FLS）的特征,细胞表面特异性标志物免疫组化、免疫荧光CD44、CD55、Vinmentin、CD90鉴定,细胞质及核膜可见大量阳性表达物质,CD68组细胞质及核膜未见明显阳性表达,于PBS对照组比较无差异,进一步证实了该细胞为成纤维样滑膜细胞（FLS）;软骨下成骨细胞（OB）呈线条状聚集分布生长,细胞呈梭形、类三角形,部分细胞借助突触相连接,卵圆形的细胞核沿细胞长轴分布。此外软骨下成骨细胞（OB）经ALP染色、茜素红染色可见大量碱性磷酸酶沉积及钙化结节产生,结合其生物学特性,证实该细胞为软骨下成骨细胞（OB）。（2）Elisa法测定模型组与假手术组豚鼠血清中雌激素水平,模型组血清雌激素含量较假手术组明显下调（P<0.05）,由此证明绝经后膝骨关节炎复合动物模型成功建立。Elisa法测定各组成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞上清液中TNF-α表达水平,结果示成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞各组细胞上清液中:与假手术组比较,模型组TNF-α表达水平明显上调（P<0.05）;与模型组相比,蠲痹胶囊组TNF-α表达水平显着下调（P<0.05）,西药组（双醋瑞因胶囊）TNF-α表达水平显着下调（P<0.05）;与西药组（双醋瑞因胶囊）相比,蠲痹胶囊组TNF-α表达水平无明显变化（P>0.05）。（3）成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞RT-PCR结果示:与假手术组相比,模型组TLR4、TRAF6基因表达水平显着上调（P<0.05）;与模型组相比,蠲痹胶囊组TLR4、TRAF6基因表达水平显着下调（P<0.01）,西药组（双醋瑞因胶囊）TLR4、TRAF6基因表达水平显着下调（P<0.01）;与西药组（双醋瑞因胶囊）相比,蠲痹胶囊组TLR4、TRAF6基因表达水平无显着变化（P>0.05）。（4）成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞Western blot结果示:与假手术组相比,模型组NF-κBp65蛋白表达水平显着上调（P<0.01）;与模型组相比,蠲痹胶囊组NF-κBp65蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,西药组（双醋瑞因胶囊）NF-κBp65蛋白表达水平显着下调（P<0.05）;与西药组（双醋瑞因胶囊）相比,蠲痹胶囊组NF-κBp65蛋白表达水平无显着变化（P>0.05）。结论:（1）成功分离培养雌性豚鼠膝骨关节炎模型成纤维样滑膜细胞（FLS）和软骨下成骨细胞（OB）,并经过纯化、鉴定,可为后续膝骨关节炎机制和通路的研究提供体外细胞模型。（2）蠲痹胶囊可能通过抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）内TLR4、TRAF6基因表达,抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）内NF-κBp65蛋白表达,降低成纤维样滑膜细胞（FLS）外TNF-α等炎性因子表达水平,调控固有免疫应答传导过程,从而减缓滑膜免疫炎症反应,延缓关节软骨及软骨下骨退变,最终达到防治绝经后膝骨关节炎的目的。（3）蠲痹胶囊可能通过抑制软骨下成骨细胞（OB）内TLR4、TRAF6基因表达,抑制软骨下成骨细胞（OB）内NF-κBp65蛋白表达,降低软骨下成骨细胞（OB）外TNF-α等炎性因子表达水平,调控固有免疫应答传导过程,从而减缓滑膜免疫炎症反应,延缓关节软骨及软骨下骨退变,最终达到防治绝经后膝骨关节炎的目的。
姚梦莉[10]（2020）在《基于RhoA/ROCK信号通路探讨理筋正骨手法对膝骨关节炎模型兔软骨细胞的作用及其机制》文中认为目的通过改良Hulth法制作膝骨关节炎模型兔,观察Rho A/ROCK信号通路表达变化、软骨细胞凋亡率及关节软骨组织形态学的改变,探讨理筋正骨手法治疗膝骨关节炎的作用机制。方法选取2.0-2.5kg成年健康SPF级新西兰大白兔40只,雄性,按照完全随机分配的原则分为正常对照组9只、假手术组9只、模型组11只、治疗组11只。适应性喂养1周后,采用改良Hulth法开始造模,建立KOA模型。分组:（1）正常对照组:常规饲养,不做任何处理;（2）假手术组:在手术过程中只打开兔膝关节腔,不破坏关节本身及周边结构,逐层缝合伤口,术后常规饲养,不做任何处理;（3）模型组:采用改良Hulth法建立膝骨关节炎兔模型:麻醉备皮常规消毒后,于兔右膝关节内侧行一纵行切口打开关节腔,切断内侧副韧带、前交叉韧带,切除内侧半月板。行侧方分离实验和抽屉实验阳性后,止血、生理盐水冲洗、逐层缝合切口,术后常规饲养,不做处理;（4）治疗组:造模方法同模型组,8周造模成功后予以理筋正骨手法治疗,方法如下:对模型兔类似人体足阳明、足太阳、足少阴、足少阳经筋对应的右下肢前后侧、内外侧肌群予以由上而下拿捏3min的放松治疗,着重治疗下肢经筋循行路线触及的条索或结节状反应点,然后在膝周以髌骨为中心于内外侧、上下处点揉各50次,点揉摇晃膝内、外侧,最后屈伸膝关节10次,治疗隔天1次,每次10min,连续治疗20次。术后第4天至8周每日驱赶模型兔活动30min,第8周处死模型组2只新西兰大白兔行HE染色观察软骨形态是否符合膝骨关节炎的病理改变,同时对模型兔行大体观察以及膝关节肿胀程度的观察,以此验证造模是否成功。造模成功后以理筋正骨手法对治疗组进行干预,其余组别的新西兰大白兔常规饲养,不做处理。干预结束后各组均取9只新西兰大白兔的关节软骨组织进行以下检测:大体观察和组织形态学观察（HE染色）,分别以Pelletier JP评分和Mankin’s评分进行评价;蛋白印迹法（wester blot）检测Rho A、ROCK蛋白表达量;Tunel法检测软骨细胞凋亡情况并计算软骨细胞凋亡率。最后对取得数据进行统计分析。结果（1）大体观察及Pelletier JP评分结果:正常对照组关节软骨表面光滑,解剖结构正常;假手术组与正常对照组基本相同;模型组膝关节明显肿大,关节软骨表面不平整,有糜烂、缺损,软骨下骨外露;治疗组膝关节肿大稍轻,关节软骨呈淡白色,光滑度尚可,表面仅见点状凹陷。与正常对照组、假手术组相比,模型组和治疗组关节软骨均有不同程度的破坏（P<0.01）,模型组破坏程度最为严重（P<0.01）,与模型组相比,治疗组软骨破环程度较轻（P<0.05）,而正常对照组与假手术组比较,破坏程度无明显差异（P>0.05）。（2）软骨组织形态学观察及Mankin’s评分结果:正常对照组关节软骨结构层次完整清晰,软骨表面平整光滑,软骨基质着色均匀,软骨细胞均匀分布于软骨组织各层;假手术组软骨表面稍欠平整,软骨细胞分布基本均匀,软骨结构层次清晰,着色均匀;模型组软骨塌陷,结构层次严重紊乱,软骨细胞分布不均,细胞数量显着减少甚至消失,着色不均匀,潮线模糊不清;治疗组软骨结构完整,软骨表层变薄,但大致平整,软骨细胞弥漫性增多、肥大,着色稍欠均匀,潮线基本清晰。与正常对照组、假手术组比较,模型组Mankin’s评分显着升高（P<0.01）,治疗组Mankin’s评分也呈现上升趋势（P<0.01）;与模型组相比,治疗组Mankin’s评分显着降低（P<0.05）,而正常对照组与假手术组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）蛋白印迹法Rho A、ROCK蛋白表达量比较:模型组Rho A、ROCK蛋白表达上升,与正常对照组及假手术组比较差异具有统计学（P<0.05）;干预组由于理筋正骨手法的介入,与模型组对比Rho A、ROCK蛋白表达量下降,差异具有统计学（P<0.05）。（4）软骨细胞凋亡情况:正常对照组可见少量凋亡的软骨细胞,均匀分布在软骨表层,假手术组与正常对照组趋势略趋于一致,模型组可见大量软骨细胞凋亡,呈片状分布,且部分凋亡核破裂,核仁呈现棕黄色;治疗组软骨细胞凋亡数量少于模型组（P<0.01）,多于正常对照组与假手术组（P<0.01）,不均匀分布于软骨组织中。结论（1）理筋正骨手法可降低Rho A、ROCK蛋白表达水平,抑制Rho A/ROCK活性。（2）理筋正骨手法可有效降低软骨细胞凋亡率,减轻软骨组织形态学的损伤程度,保护关节软骨。（3）理筋正骨手法作为一种良性的机械力刺激,对膝骨关节炎具有一定的治疗效果。
二、丝裂原活化蛋白激酶通路在髁突软骨细胞力学信号转导过程中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丝裂原活化蛋白激酶通路在髁突软骨细胞力学信号转导过程中的作用（论文提纲范文）
（1）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）关节盘及关节囊中过表达Fgf8抑制颞下颌关节腔化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物模型 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 2.方法 |
| 3.统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 颞下颌关节发育及机械传导对关节发育的影响 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 攻读学位期间获奖情况 |
| 攻读学位期间参与科研项目情况 |
| 致谢 |
（3）从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 改良Hulth法建立OA模型及检测模型中昼夜节律蛋白Bmal1、Clock的表达 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 行为学观察指标及方法 |
| 2.4 取材及检测方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 旷场实验 |
| 3.2 足底痛阈测试实验 |
| 3.3 大鼠关节活动度 |
| 3.4 大鼠膝关节影像学检查 |
| 3.5 软骨标本HE染色及Mankin′s评分 |
| 3.6 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α的含量 |
| 3.7 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的表达 |
| 3.8 免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目前使用的膝骨关节炎动物模型 |
| 4.2 模型成功的依据 |
| 4.3 关节炎模型昼夜节律存在异常 |
| 实验二 不同配穴方法对大鼠OA模型炎症及昼夜节律蛋白Bmal1、Clock的影响 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 针刺治疗方法 |
| 2.4 行为学观察指标及方法 |
| 2.5 取材及检测方法 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 旷场实验 |
| 3.2 足底痛阈测试实验 |
| 3.3 大鼠关节活动度 |
| 3.4 软骨标本HE染色及Mankin′s评分 |
| 3.5 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α |
| 3.6 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的表达 |
| 3.7 免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 针灸疗法的取穴规律 |
| 4.2 从肝论治针灸治疗OA的理论依据 |
| 4.3 从肝论治针灸治疗OA的探讨 |
| 实验三 从肝论治针灸调控昼夜节律蛋白Bmal1、Clock介导ERK1/2信号通路抑制大鼠OA模型炎症的机制 |
| 1 材料、仪器、试剂 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及处理 |
| 2.2 动物模型制备及ERK抑制剂使用方法 |
| 2.3 针刺治疗方法 |
| 2.4 取材及检测方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 软骨标本HE染色及Mankin’s评分 |
| 3.2 免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α |
| 3.3 免疫荧光法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白的表达 |
| 3.4 免疫印迹法检测软骨组织中p-ERK、IL-1β、TNF-α、Bmal1、Clock蛋白的含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MAPK/ERK信号通路的介绍 |
| 4.2 软骨基质与ERK1/2 信号通路的关系 |
| 4.3 炎症因子与ERK1/2 信号通路的关系 |
| 4.4 从肝论治针灸对大鼠ERK1/2 信号通路的影响 |
| 全文讨论 |
| 1 中医对OA的认识 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 辨证分型 |
| 1.4 针灸治疗OA的概况 |
| 2 现代医学对膝骨关节炎的研究进展 |
| 2.1 现代医学对OA发病机制的认识 |
| 2.2 炎症物质对OA的影响 |
| 2.3 昼夜节律失常对OA的影响 |
| 2.4 ERK1/2 信号通路对OA的影响 |
| 3 “补疏结合”是从肝论治针灸防治OA的重要取穴原则 |
| 结语 |
| 本研究的创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 文献综述 从肝论治针灸治疗膝骨关节炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 博士期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
（4）NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TMJOA患者与TMJID患者颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质的表达研究 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在大鼠TMJOA组织的表达研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 流体剪切力干预对软骨细胞焦亡的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向NLRP3炎性小体治疗炎症疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（5）节律基因Bmal1通过调控MAPK/ERK信号通路介导颞下颌骨关节炎的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验一 睡眠节律紊乱对髁突软骨节律基因Bmall和MAPK/ERK信号通路的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验二 Bmall与MAPK/ERK信号通路的相关性和其调控髁突软骨细胞及基质代谢的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 Bmall对TMJ-OA大鼠MAPK/ERK信号通路的影响及其调控软骨细胞及基质代谢的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（6）乌头注射液对兔膝骨关节炎软骨细胞JNK表达的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 膝骨关节炎的研究进展 |
| 1.1 中医学对膝关节骨性关节炎的认识 |
| 1.2 KOA的西医研究进展 |
| 2 乌头及乌头注射液的研究进展 |
| 2.1 中医学对乌头的认识 |
| 2.2 乌头的现代药理学研究 |
| 2.3 乌头注射液的相关探讨 |
| 3 MAPK/JNK信号通路的研究概况 |
| 3.1 什么是MAPK/JNK信号通路 |
| 3.2 MAPK/JNK通路的信号转导机制 |
| 3.3 JNK的表达与骨关节炎 |
| 3.4 MAPK/JNK信号通路与OA的治疗 |
| 实验方法 |
| 1 动物实验 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验相关药物及试剂 |
| 1.3 动物模型制备 |
| 1.4 实验给药 |
| 1.5 标本采集与固定 |
| 2 实验数据检测及统计 |
| 2.1 HE染色法 |
| 2.2 PV二步法免疫组化 |
| 实验结果 |
| 1 关节软骨肉眼观察结果 |
| 2 HE染色下组织病理学检测结果 |
| 3 PV二步法免疫组化结果 |
| 讨论 |
| 1 实验动物模型的选择 |
| 2 阳性对照药物的选择 |
| 2.1 玻璃酸钠注射液 |
| 2.2 正清风痛宁注射液 |
| 3 实验结果的讨论 |
| 4 实验所涉及的通路 |
| 5 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 个人简历 |
（7）Wnt/β-catenin信号通路在功能矫形力过载致大鼠TMJ OA中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 功能矫形力过载致髁突软骨下骨出现骨吸收及软骨下骨中Wnt/β-catenin信号通路活化 |
| 1 实验仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和抗体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物的选择与分组 |
| 2.2 大鼠前伸下颌模型的建立 |
| 2.3 大鼠TMJ标本的处理 |
| 2.4 HE染色 |
| 2.5 番红O/固绿(SO)染色 |
| 2.6 TRAP染色 |
| 2.7 免疫组化染色 |
| 2.8 Micro-CT扫描 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 实验组大鼠髁突软骨形态改变 |
| 3.2 实验组大鼠髁突软骨下骨出现明显骨吸收 |
| 3.3 髁突软骨下骨骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达比较 |
| 3.4 TRAP染色结果 |
| 3.5 OPG/RANKL蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 抑制髁突软骨下骨Wnt/β-catenin信号通路活化加速软骨下骨骨丧失 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物的选择与分组 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠前伸下颌模型的建立 |
| 2.2 药物注射 |
| 2.3 TMJ髁突标本的处理 |
| 2.4 HE 染色、番红 O/固绿 (SO)染色 |
| 2.5 TRAP染色 |
| 2.6 免疫组化染色 |
| 2.7 Micro-CT扫描 |
| 3 结果 |
| 3.1 加入DKK1抑制剂后大鼠髁突的组织学变化 |
| 3.2 Micro-CT结果 |
| 3.3 抑制Wnt/β-cantenin信号通路加速实验组髁突软骨下骨骨丧失 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的研究成果 |
| 临床病例汇报 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
（8）骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 成骨细胞的分离、培养与鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 骨粘连蛋白影响成骨细胞矿化期非胶原蛋白基因的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 骨粘连蛋白对其它矿化指标的影响及SB203580的阻断效应 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四部分 AD-p38及p38-rhRNA病毒载体构建 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第五部分: P38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中信号通路作用的进一步研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 生物矿化及仿生的机制研究及应用 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表文章一览表 |
| 致谢 |
（9）补肾益气方蠲痹胶囊对绝经后膝骨关炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 上篇 文献综述膝骨关节炎发病机制相关信号通路实验研究进展 |
| 1 与KOA软骨细胞增殖相关信号通路 |
| 1.1 Notch信号通路 |
| 1.2 Wnt信号通路 |
| 2 与KOA软骨细胞凋亡相关信号通路 |
| 2.1 TLR4信号通路 |
| 2.2 MAPKs信号通路 |
| 2.3 TGF-β/Smads信号通路 |
| 3 其它信号通路在膝骨关节炎中的作用 |
| 3.1 Cofilin信号通路与KOA |
| 3.2 SDF-1/CXCR4 信号通路与KOA |
| 4 小结 |
| 下篇 实验研究 补肾益气方蠲痹胶囊对绝经后膝骨关节炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路影响的研究 |
| 实验一 膝骨关节炎(KOA)动物模型成纤维样滑膜细胞(FLS)和软骨下成骨细胞(OB)分离培养及鉴定 |
| 1 实验概述 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 耗材与仪器 |
| 2.4 KOA动物模型建立 |
| 2.5 原代细胞分离培养、传代 |
| 2.6 制作细胞爬片 |
| 2.7 滑膜细胞和软骨下成骨细胞形态学鉴定 |
| 2.8 FLS生物标记物鉴定 |
| 2.9 OB鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 成纤维样滑膜细胞(FLS)镜下观察 |
| 3.2 软骨下成骨细胞(OB)显微镜下观察 |
| 3.3 FLS苏木精-伊红(HE)染色结果 |
| 3.4 OB苏木精-伊红(HE)染色结果 |
| 3.5 FLS生物标记物鉴定结果 |
| 3.6 OB鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 补肾益气方蠲痹胶囊对绝经后膝骨关节炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路影响的研究 |
| 1 实验概述 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 动物 |
| 2.2 细胞 |
| 2.3 主要药品及试剂 |
| 2.4 主要器材及仪器 |
| 2.5 动物分组、造模及给药方法 |
| 2.6 含药血清制备 |
| 2.7 含药血清最适浓度筛选及干预细胞 |
| 2.8 检测方法及指标 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清雌激素表达水平 |
| 3.2 成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞上清液中TNF-α表达水平 |
| 3.3 总RNA浓度、纯度检测结果 |
| 3.4 cDNA浓度、纯度检测结果 |
| 3.5 成纤维样滑膜细胞内TLR4、TRAF6 基因表达水平 |
| 3.6 软骨下成骨细胞内TLR4、TRAF6 基因表达水平 |
| 3.7 成纤维样滑膜细胞及软骨下成骨细胞内NF-κp65蛋白表达水平 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（10）基于RhoA/ROCK信号通路探讨理筋正骨手法对膝骨关节炎模型兔软骨细胞的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 动物模型的制作 |
| 1.2.3 造模评价 |
| 1.2.4 干预方法 |
| 1.3 观察项目 |
| 1.3.1 大体观察 |
| 1.3.2 HE染色 |
| 1.3.3 组织学评分 |
| 1.3.4 蛋白印迹法(wester blot) |
| 1.3.5 tunel细胞凋亡测定 |
| 1.4 数据的统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 造模前各组兔体重比较 |
| 2.2 兔大体观察及组织形态学情况 |
| 2.2.1 大体观察及Pelletier JP评分 |
| 2.2.2 HE染色及Mankin’s关节软骨病理评分 |
| 2.3 wester blot及 Rho A/ROCK蛋白含量测定 |
| 2.4 tunel及软骨细胞凋亡率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 膝骨关节炎的发病机制 |
| 3.1.1 中医学对KOA的认识 |
| 3.1.2 西医学对KOA的认识 |
| 3.1.3 KOA的致病因素 |
| 3.2 理筋正骨手法治疗KOA的机制研究 |
| 3.2.1 理筋正骨手法的作用 |
| 3.2.2 理筋正骨手法对软骨组织形态学及软骨细胞凋亡的影响 |
| 3.2.3 理筋正骨手法对RhoA/ROCK信号转导通路的影响 |
| 3.3 本实验不足之处 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨关节炎软骨细胞凋亡途径及其力学刺激相关信号通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、丝裂原活化蛋白激酶通路在髁突软骨细胞力学信号转导过程中的作用（论文参考文献）
- [1]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]关节盘及关节囊中过表达Fgf8抑制颞下颌关节腔化的机制研究[D]. 周海玲. 大连医科大学, 2021(01)
- [3]从肝论治针灸对OA模型大鼠软骨损伤的效应机制研究[D]. 周晓红. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [4]NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用[D]. 贾梦莹. 新疆医科大学, 2021(08)
- [5]节律基因Bmal1通过调控MAPK/ERK信号通路介导颞下颌骨关节炎的机制研究[D]. 陈国昆. 山东大学, 2020(04)
- [6]乌头注射液对兔膝骨关节炎软骨细胞JNK表达的影响[D]. 刘陆. 黑龙江省中医药科学院, 2020(02)
- [7]Wnt/β-catenin信号通路在功能矫形力过载致大鼠TMJ OA中的作用[D]. 刘美希. 青岛大学, 2020(01)
- [8]骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究[D]. 朱云森. 苏州大学, 2020(06)
- [9]补肾益气方蠲痹胶囊对绝经后膝骨关炎动物模型TLR4/NF-κB信号通路影响的研究[D]. 陈松. 陕西中医药大学, 2020(01)
- [10]基于RhoA/ROCK信号通路探讨理筋正骨手法对膝骨关节炎模型兔软骨细胞的作用及其机制[D]. 姚梦莉. 安徽中医药大学, 2020(03)