一、EB病毒相关疾病的病毒表达和人dUTP酶（论文文献综述）
张静远[1]（2021）在《非洲猪瘟病毒L7L-L11L基因功能鉴定及疫苗候选株研究》文中提出非洲猪瘟（Africanswine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus,ASFV）感染家猪或野猪引起的一种急性出血性传染病。该病2018年传入我国,给我国养殖业带来重大损害。其病原ASFV为有囊膜的双链DNA病毒,基因组长达170kb-190kb,含160-175个开放阅读框,编码150-200种蛋白,其中多数蛋白功能尚不明确。当前尚无非洲猪瘟疫苗面世,阐明未知基因功能,筛选和发掘免疫相关基因是研制非洲猪瘟疫苗的关键。本研究以ASFV右末端功能未知的一段基因片段L7L-L11L（含L7L、L8L、L9R、L10L、L11L共5个基因）为研究对象,开展研究:1.分析L7L-L11L整段基因片段在不同毒株间的保守性,构建L7L-L11L基因片段缺失毒株SY18ΔL7-11,探究该片段缺失对ASFV体外生物学特性的影响;2.研究SY18ΔL7-11较亲本毒株ASFV SY18对猪致病力的差异及引起机体免疫应答规律的差异,解析L7L-L11L片段对ASFV的可能作用;3.构建L7L-L11L片段涉及的5个ORFs（L7L、L8L、L9R、L10L、L11L）单独缺失的单基因缺失株,研究其生物学特性,以明确关键毒力相关基因;4.以L7L-L11L整段基因片段缺失株SY18ΔL7-11为基础,分别联合缺失已知毒力相关基因CD2v或MGF360/505,构建2个双基因缺失株,分别评价其安全性和免疫保护效果,研究其作为疫苗候选株的可能性。通过以上试验,获得以下研究结果:1.L7L-L11L基因片段在同基因型毒株间高度保守,缺失L7L-L11L基因片段后,SY18ΔL7-11在体外巨噬细胞的增殖规律与亲本毒株一致,缺失该基因片段未改变病毒粒子形态及红细胞吸附特性。2.分别以低剂量（103 TCID50）和高剂量（106 TCID50）的SY18ΔL7-11接种猪后,12头接种试验猪中,仅低剂量组死亡1头;接种后28日以亲本株ASFV SY18攻毒后,11头猪全部存活;与亲本毒株相比,基因缺失病毒可诱导机体ASFV特异性抗体产生及IFN-γ分泌。3.构建的L7L、;8L、L9R、L10L、L11L的单基因缺失病毒即SY18ΔL7L、SY18ΔL8L、SY18ΔL9R、SY18ΔL10L、SY18ΔL11L,体外生长曲线均与亲本毒株一致,接种猪后,至21天观察期末,SY18ΔL7L 感染猪存活率 25%（1/4）,SY18ΔL11L 感染猪存活率 100%（4/4）,SY1 8ΔL8L、SY18ΔL9R、SY18ΔL10L存活率均为0。说明L7L和L11L可能为ASFV毒力相关基因。4.SY18ΔL7-11联合CD2v、MGF360/505缺失后,构建的2个双基因片段缺失株SY18ΔL7-11ACD2v、SY18ΔL7-11AMGF,均具有良好的安全性,免疫后28天内动物未出现发热等临床症状,以亲本株ASFV SY18攻毒后观察21天,SY1 8ΔL7-11AMGF免疫组保护率40%（2/5存活）;SY18ΔL7-11ACD2v组免疫保护率80%。说明,双基因片段缺失后,相对于L7L-L11L基因片段单独缺失安全性得到进一步提高,SY18ΔL7-11联合CD2v基因双缺失保留了足够的免疫保护原性,而联合MGF360/505基因双缺失导致免疫原性的显着丧失。综上,本研究（1）首次证明ASFV基因组右末端的L7L-L11L基因片段缺失不改变病毒的体外增殖、形态和红细胞吸附特性,但显着改变了病毒对猪的致病力;（2）并首次明确L7L及L11L为ASFV毒力相关基因;（3）在L7L-L11L基础上联合缺失CD2v得到的双基因片段缺失株是较为安全的ASF候选疫苗,可产生80%的有效保护。以上结果为ASFV毒力相关基因及其致病机制的阐明提供了重要参考数据,也为L7L-L11L基因片段缺失ASFV为基础联合其他基因缺失构建安全有效的双或多基因缺失候选疫苗奠定了重要基础。
周小钰[2]（2020）在《非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的研制及间接ELISA抗体检测方法的建立》文中提出非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染猪引起的一种高度接触传染性疾病。在强毒株感染的情况下,感染家猪的死亡率极高,甚至可达到100%。ASF被OIE规定为法定报告的动物疫病,同时ASF在我国属于一类动物疫病。自2018年8月我国首次确诊ASF,随后ASF疫情在我国多地爆发,沉重打击了我国养猪业。目前临床上对于ASFV的防控仍缺乏安全、有效的疫苗,因此建立快速准确的ASFV诊断方法,对于临床上防控该病极其重要。ASFVp30蛋白是由基因组中开放阅读框CP204L编码的一种结构蛋白,并且在病毒感染早期大量出现。p30蛋白具有良好的抗原性,是一种理想的免疫学检测抗原。本研究通过构建ASFV p30蛋白的真核和原核表达质粒,利用原核表达重组蛋白进行免疫并最终研制出特异性针对p30蛋白的单克隆抗体,为ASF的快速诊断方法和免疫预防等研究提供基础生物材料。主要研究内容及研究结果包括以下三部分:1.非洲猪瘟病毒p30基因的克隆及表达本研究依照GenBank上已发布的非洲猪瘟病毒p30基因序列设计合成一对特异性扩增引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因并将其分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1和原核表达载体pET-32a中,构建成真核重组质粒pcDNA3.1-p30及原核重组质粒p30-his。将测序正确的真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞,应用间接免疫荧光（IFA）和Western Blot实验进行分析,结果显示真核重组质粒pcDNA3.1-p30可以在293T细胞上获得表达并且与ASFV阳性猪血清反应良好。将测序正确的原核表达质粒p30-his转化BL21（DE3）感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组菌表达,通过SDS-PAGE和Western Blot实验证实该重组蛋白可以获得表达且主要是以包涵体的形式存在,分子量大小约为42 kDa,与预期一致。2.非洲猪瘟病毒p30单克隆抗体的研制本研究以p30原核重组蛋白作为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,每间隔10天免疫一次,免疫三次后应用IFA测定小鼠血清效价,选择效价较高的小鼠进行细胞融合。真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞后应用IFA对杂交瘤细胞上清进行筛选并对阳性细胞进行亚克隆,最终获得两株能稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为ASFV-p30-2F9和ASFV-p30-3F9。以真核重组质粒pcDNA3.1-p30转染293T细胞裂解蛋白为抗原,应用Western Blot实验进行验证后证明获得的两株单克隆抗体均能与p30原核和真核表达蛋白发生特异性反应。亚类鉴定结果表明两株单克隆抗体均为IgG1亚类/Kappa链。用获得的两株杂交瘤细胞制备小鼠腹水,并对两株单抗腹水进行IFA效价测定,结果表明ASFV-p30-2F9单抗腹水IFA效价为1:6400,ASFV-p30-3F9单抗腹水IFA效价为1:3200。3.非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA的反应条件,确定了最佳抗原包被浓度为0.25 μg/mL、待检血清1:400稀释、封闭液和封闭时间选择5%脱脂乳封闭2h、一抗最佳作用时间为1h、二抗最佳作用时间为1h、最佳显色时间为10 min。运用本检测方法检测PRV、PEDV、CSFV阳性血清,结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。通过对12份ASFV阴性血清检测确定ELISA方法临界值,当OD450nm≤0.284时为阴性,OD450nm≥0.341时为阳性,待检血清OD450nm值在两者之间判为可疑,该ELISA方法批内批间重复性良好,变异系数均小于10%。可用于非洲猪瘟病毒感染的监控。
王家顺[3]（2018）在《山羊关节炎脑炎病毒编码蛋白逃逸先天性免疫的分子机制》文中研究说明山羊关节炎脑炎是由山羊关节炎脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV）引起的慢性进行性传染病,严重威胁养羊业发展。慢性感染,终身带毒,多组织炎症是该病的主要特征。抗病毒先天免疫反应是宿主防御系统的重要组成部分,通过早期感知病毒的入侵并快速启动防御机制来抑制病毒感染。干扰素β（Interferonβ,IFN-β）是评价先天免疫反应的重要标志分子,具有广谱的抗病毒和免疫调节作用。CAEV感染机体对IFN-β的影响还不清楚。为了解CAEV感染对宿主细胞先天性免疫的影响,本文分析了6种CAEV基因编码蛋白在细胞中的作用,研究了它们在IFN-β产生过程中的分子机制,为认识CAEV的致病及免疫机理提供依据。主要结果如下:（1）不同CAEV编码蛋白对细胞IFN-β转录表达的影响:病毒编码蛋白在病毒感染调节中具有重要作用,本研究选取了参与CAEV增殖调节的蛋白酶RVP、dUTP酶DU、利于病毒RNA合成的蛋白Tat、促进病毒基因组整合的蛋白IN、调节蛋白Vif及主要抗原蛋白P25,分别构建了其真核表达载体并转染293T细胞,接种SeV或VSV病毒,检测不同病毒编码蛋白对IFN-β产生的影响,通过qRT-PCR、荧光显微镜检测SeV、VSV-GFP的增殖情况。结果表明,DU和Vif可以抑制IFN-β转录及表达,促进病毒SeV、VSV的增殖,其他蛋白对IFN-β的表达无显着影响。（2）DU和Vif对抑制IFN-β产生信号通路的影响:应用qRT-PCR和荧光素酶报告系统,研究了DU和Vif对IFN-β及其调控转录因子产生的影响。应用RIG-I/MDA5/MAVS/TBK1质粒转染细胞激活IFN-β途径,通过检测由ISRE、和NF-κB 2种不同转录因子控制下的荧光酶活性表征IFN-β产生情况,结果显示,过表达DU和Vif可抑制由ISRE、NF-κB和IFN-β启动子控制下的荧光酶活性;但过表达DU或Vif蛋白,并不影响IRF3活化的IFN-β启动子调控下的荧光酶活性,这表明,DU和Vif是通过负调控IRF3上游信号转导分子的活性,抑制IFN-β信号通路的激活。缺失Vif蛋白149-164位氨基酸,其对IFN-β的抑制作用明显减弱,表明该区段氨基酸序列,对抑制IFN-β产生、促进CAEV感染具有重要作用。综上,本文发现CAEV基因编码的DU和Vif蛋白,可通过下调ISRE和NF-κB控制的IFN-β的转录,抑制IFN-β的产生,其抑制IFN-β信号通路位于IRF3上游。我们的结果表明,CAEV可通过其编码的DU和Vif蛋白,下调IFN-β的产生从而逃逸宿主细胞先天免疫反应,促进病毒的增殖。
李解珍,张声[4]（2018）在《外泌体在病毒性疾病传播中的作用研究进展》文中研究指明外泌体是一种由细胞释放到细胞外空间的脂质双层膜结构的小囊泡;直径30～150nm,密度为1.13～1.19 g/mL。几乎所有的细胞均可分泌外泌体,后者存在于多种体液中,如血液、乳液、尿液、唾液、羊水、恶性腹水、关节滑液、脑脊液和精液等[1]。1983年,有学者发现在网织红细胞发育为成熟红细胞过程中,一种小囊泡被释放到细胞外空间。1987年,有学者将这些小囊泡命名为外泌体。细胞外囊泡包括膜
徐兴丽[5]（2017）在《HSV-1突变毒株的构建及其生物学特性和免疫原性分析》文中研究指明人类疱疹病毒作为一个由8个成员组成的DNA病毒家族,在全球不同人群中均具有较高的感染率,尤其是其中的HSV-1和HSV-2等病原所引起的包括口唇疱疹、生殖器官疱疹以及疱疹性脑炎等常见感染,已成为青少年人群中的重要传染性疾病,并受到公共卫生领域的广泛关注。因此,针对这一病原的相关临床治疗和预防性制品的研究已经得到了多方面的推进。迄今为止,尽管阿昔洛韦类药物已经在临床上得到了广泛的应用,但有关HSV-1和HSV-2的多个疫苗临床研究均未提供具有应用意义的结果。基于HSV-1和HSV-2感染病理的特征探索合适的疫苗形式以诱导有效的临床保护效率显然是目前一个重要的研究方向。我们前期关于HSV-1与宿主相互作用的分子相关研究以及HSV-1相关突变株的构建技术的研究,为进一步针对HSV-1衣被蛋白在病毒生物学特性及其毒力表型变化中的作用分析提供了初步的资料。在此基础上,本文的主要工作描述了一个具有转录调控作用的HSV-1衣被蛋白UL7突变后对HSV-1毒力表型的影响,及其可能机理的研究过程。基于这一突变毒株的生物学特性,我们在其基础上完成了 HSV-1复制过程中的重要调控分子Vhs编码基因u141和与潜伏感染的建立和维持密切相关的LAT基因的突变,构建了突变毒株M2和M3,并对三株毒株的生物学特性及致病性进行了分析。最后,我们以突变毒株M3为研究重点,评价了其在小鼠模型上的免疫原性,为HSV-1减毒病毒的研究提供了初步的基础。在第一部分工作中,针对UL7突变的毒株M1的分析表明,突变毒株M1表现出细胞水平的低增殖能力以及动物水平的急性期感染能力的下降,进一步的体外实验还表明UL7蛋白可能通过参与染色质化α-4基因而起到调控其转录激活的作用。在第二部分工作中,突变毒株M1、M2和M3的生物学特性分析结果表明,与野生型毒株相比,突变毒株M3在细胞中的增殖能力显着降低,在小鼠体内的致病能力和潜伏能力均显着降低,提示了 M3毒株的减毒特性。基于前两部分的研究资料,我们将突变毒株M3作为减毒活疫苗候选株免疫小鼠,并在免疫后1个月和2个月时分别予以野生型毒株滴鼻感染。随后的临床症状观察、免疫学、组织病理学和病毒载量测定结果显示,突变毒株M3免疫后诱导的以中和抗体和CD8+T细胞免疫反应为特征的免疫反应在针对野生型毒株攻击情况下,能够有效控制野生型毒株感染引起的多种临床症状,抑制野生型毒株在小鼠体内的增殖,显着减轻野生型毒株感染引起的病理损伤,限制野生型毒株在神经系统的潜伏感染过程。这些结果均表明了突变毒株M3可作为减毒活疫苗候选株的潜在可能。
刘强[6]（2015）在《马传染性贫血病毒在马基因组上整合特征的分析》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）与人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）同属于逆转录病毒科慢病毒属。EIAV是感染马属动物的重要传染病病原和用于慢病毒相关研究的重要模型病毒。上世纪七十年代,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成功研制出EIAV中国弱毒疫苗株。该疫苗株能够诱导马属动物产生良好的免疫保护,是唯一成功大规模应用的慢病毒疫苗株。对于EIAV亲本强毒株致弱过程中的各代次不同毒力的毒株,尤其最终获得的疫苗弱毒株的生物学特性研究,将对研究有效慢病毒疫苗提供借鉴,具有重要的科学意义。前期研究发现,即便宿主的免疫系统受到抑制,该疫苗株仍能保持其稳定的低水平复制,提示是病毒自身的弱化,而不是宿主的免疫系统,是EIAV弱毒疫苗株体内低水平复制的主要原因。逆转录病毒能够将其基因组以前病毒DNA的形式整合到宿主基因组,已有研究提示,前病毒DNA发生整合的宿主基因组环境对病毒的转录和复制有明显影响。EIAV,特别是EIAV中国弱毒疫苗株的宿主基因组整合特性如何?是否与其在宿主体内的低水平复制相关?对这些问题解答,有助于进一步了解EIAV弱毒疫苗株毒力致弱的机制。本研究以EIAV致弱过程中的3个关键毒株,即驴白细胞适应性强毒株EIAVDLV34、驴白细胞适应性弱毒疫苗株EIAVDLV121、以及驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13为研究对象,我们对各毒株在马基因组上的整合位点选择特征进行了实验研究,重点比较了强、弱毒株在整合位点选择上是否存在差异,并基于获得的实验数据,尝试探究EIAV疫苗弱毒株对宿主基因组的整合特征与其毒力弱化间的可能关联。开展的具体实验研究为:用EIAVDLV34和EIAVDLV121体外分别感染马巨噬细胞,用EIAVFDDV13感染马胎皮肤细胞。提取被感染细胞的基因组DNA,并经限制性内切酶Ssp I与Dra I片段化后,与DNA接头连接。使用接头介导的聚合酶链式反应（Linker-mediated PCR,LM-PCR）扩增EIAV前病毒整合位点接头序列,再经克隆、测序,判定并获得准确的整合位点序列信息。本研究中,我们成功地获得了共计1,103个EIAV整合位点信息,具体包括EIAVDLV34感染组的101个位点信息,EIAVDLV121感染组的525个位点信息,以及EIAVFDDV13感染组的477个位点信息。对以上获得的整合位点信息,完成以下六方面特性分析:①染色体定位、②插入基因频率、③前病毒相对于转录起始位点的插入方向、④整合位点相对于转录起始位点的距离、⑤是否插入重复元素、⑥整合有EIAV前病毒的宿主基因的功能注释（Gene ontology,GO）分析。分析结果表明,首先,三种EIAV毒株在马基因组上发生的整合事件是非随机性的。其次,各毒株的整合特征间具有一定程度的共性和差异。共性之处在于:①三种EIAV毒株均对马基因组上转录单位（Transcription units,TUs）区域,尤其内含子具有明显的偏向性（P<0.01）;②在整合位点处均形成较弱的回文结构;③整合过程倾向发生在基因组上富含AT的区域、④基因密度为2140个/2Mb的基因组区域和⑤长散在核元素（Long interspersed elements,LINEs）,其中LINE1尤其支持EIAV发生整合事件（P<0.01）,这不同于HIV-1,后者倾向于在短散在核元素（Short interspersed elements,SINEs）发生整合。⑥但EIAV对于SINEs和转录起始位点无任何偏向性。⑦此外,GO分析表明,3种EIAV毒株前病毒均插入负责转录调节、离子结合与ATP结合功能的宿主基因簇。不同之处在于:①除LINE1外,在染色体上其它种类的重复元素中,DNA支持两种弱毒疫苗株EIAVDLV121和EIAVFDDV13发生整合事件（P<0.05）;②EIAVDLV121和EIAVFDDV13也在低基因密度区域（1120个/2Mb）发生整合;③GO分析结果也表明,整合有疫苗弱毒株EIAVDLV121和EIAVFDDV13的前病毒的宿主基因也负责DNA损伤刺激反应、宿主适应性免疫反应、淋巴细胞分化、凋亡、脂筏的合成过程和氧化还原生物学过程。此外,与已有关于EIAV载体（VSV-G）对人类基因组整合特征的比较分析,可以发现:①EIAV整合特征与其感染宿主选择的路径无关（EIAV env或者VSV-G）;②无论对人或马,宿主基因组的转录单位均倾向于被EIAV选择作为整合位点。基于以上研究,一方面我们发现EIAV前病毒DNA高频率地插入LINEs及DNA转座子,而LINEs及DNA转座子具有影响其附近基因转录及表达的作用,因此存在EIAV前病毒通过插入该区域对自身复制等过程产生反馈性抑制的可能,进而与病毒毒力弱化产生关联;另一方面,一些整合有疫苗弱毒株前病毒的宿主基因参与免疫反应相关生物学过程,是否与其诱导良好的免疫保护有关,也是值得进一步深入探讨的课题。本研究获得的全部研究信息,将促进我们对EIAV,尤其EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时,对EIAV在马基因组上的整合位点选择特征的探讨,将为进一步研究慢病毒感染与宿主应答间的相互作用特征,以及为以慢病毒为转基因治疗载体的相关研究,提供重要数据支持。
刘畅[7]（2014）在《JSRV囊膜蛋白及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化与分子发生机制的研究》文中研究表明研究背景：绵羊肺腺瘤（ovine pulmonary adenomatosis, OPA）是由绵羊肺腺瘤病毒（jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV）引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤疾病。JSRV属于p逆转录病毒属,基因组主要包含病毒的结构基因gag、pro、pol和env。其中env是一个癌基因,它的表达产物囊膜蛋白（Env）由表面蛋白（SU）和穿膜蛋白（TM）两个亚基组成,彼此间以二硫键相连。JSRV的受体为透明质酸酶2（Hyaluronoglucosaminidase2, Hyal-2）。由于NIH3T3细胞具有强烈的接触抑制特性,能根据失去接触抑制而明确地识别已发生转化的细胞,故作为一种重要的细胞用于JSRV致瘤机制的研究。近年的研究显示,单独表达JSRV Env对于诱导NIH3T3细胞转化是必须和充分的,但其具体的转化分子机制中仍存在一些值得探讨的地方。研究目的：进一步探究JSRV Env及其亚基（SU和TM）诱导NIH3T3细胞转化的分子机制,这对于深入阐明OPA的分子发病机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究方法：1.应用RT-PCR的方法从绵羊瘤胃组织总RNA中扩增Hyal-2的编码序列,构建含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒。将该真核表达质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选、纯化后,以制备稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.采用JSRV Env及其亚基真核表达质粒分别诱导转化NIH3T3细胞和稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系,并检测比较各转染组与空白对照组间,细胞的接触抑制特性、非锚定依赖性生长能力、增殖活性以及磷酸化Akt含量的差异。3.设计小鼠源kras、nras、egfr、p53和pik3ca肿瘤相关基因常见突变所在外显子的突变点检测引物,采用PCR-SSCP和核酸测序分析法检测JSRV Env及其亚基诱导转化细胞中肿瘤相关基因的突变情况。4.以内蒙古地区OPA自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆JSRV前病毒的gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与已有的LTR、env基因连接起来,以获得含有JSRV前病毒全基因组的重组质粒。研究结果：1.成功构建了含有绵羊Hyal-2基因编码区的真核表达质粒pcDNA-Hyal2-HA,并建立了稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系。2.在NIH3T3细胞中,Env及TM具有诱导细胞转化、激活Akt的能力；而在稳定表达绵羊Hyal-2受体的NIH3T3细胞系中,仅TM具有这样的能力。3.在JSRV Env及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的过程中,肿瘤相关基因kras、nras、egfr、p53和pik3ca均未发生突变。4.成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。核酸序列分析结果表明,本研究重组克隆的pMD-JSRV基因组全长7690bp,具外源性JSRV典型的分子特征,属JSRV-Ⅱ型,与分离自美国的代表株AF105220亲缘关系较近,同源性达95%。结论：1.本研究成功构建了稳定表达绵羊Hyal-2受体NIH3T3细胞系。2.在JSRV Env诱导NIH3T3细胞转化并激活Akt的过程中,其TM亚基起到了主要作用,并且TM亚基还具有单独诱导NIH3T3细胞转化的能力。3.绵羊Hyal-2具有抑制JSRV Env诱导NIH3T3细胞转化的作用。4.JSRV Env及其亚基诱导NIH3T3细胞转化的分子机制与肿瘤相关基因突变可能无关。5.本研究成功构建了包含外源性JSRV前病毒基因组全长的重组质粒pMD-JSRV。这为进一步研究JSRV其他结构蛋白对其Env诱导NIH3T3细胞转化的影响建立了实验平台。
汤艳东[8]（2014）在《马病毒抑制蛋白Viperin抑制马传染性贫血病毒复制的机制》文中研究表明宿主抵抗病毒感染的第一道防线就是固有免疫反应。固有免疫反应以干扰素的产生为特征,之后干扰素诱导细胞内大量的干扰素诱导的抗病毒蛋白。虽然一些干扰素诱导的蛋白,如PKR, Mx1, RNaseL, ISG15, APOBEC3G, Tetherin, IFIT等的抗病毒功能已经被阐明,但是干扰素诱导的绝大多数基因的功能尚不清楚。Viperin （Viperin, virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible）是干扰素诱导的内质网相关的具有抗病毒功能的蛋白。近来来,对于Viperin的研究受到了越来越多的关注。研究表明Viperin基因的功能是多种多样的,从抗病毒作用到调节信号通路都发挥重要的作用。Viperin对许多种类病毒的复制都有影响,这些病毒主要包括流感病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、登革热病毒,可以抑制这些病毒的复制。有趣的是,对于人的巨细胞病毒（HCMV）,干扰素诱导的内质网相关的抗病毒蛋白可以增加该病毒的感染性。相关研究表明,这种感染性的增加是通过细胞内骨架系统的重建来实现的。Viperin对于慢病毒的作用研究并不是很多,比如人免疫缺陷病毒HIV-1,对其与Viperin的关系尚不是很明确。有些结果甚至有矛盾。比如,一组研究者证实,该基因可以抑制HIV-1的复制,这种抑制是通过抑制病毒的出芽来实现的。另一组研究表明,Viperin只对特定毒株的HIV-1有抑制作用,而对于其他绝大多数的毒株却没有起作用。因此,需要更多的研究来探索Viperin在慢病毒中所起的作用。马传染性贫血病毒（EIAV）是与HIV-1相似的病毒,是反转录病毒科慢病毒属中基因结构最简单的病毒。感染马传染性病毒的马匹通常以反复发热为特征,同时伴有病毒血症,发热,血小板减小症和衰竭症状。EIAV是巨噬细胞嗜性的病毒。感染的巨噬细胞是病毒的储存库,在整个马传染性贫血的发病过程中产生病毒准种以及作为病毒的扩散源。由于马传染性贫血病毒的研究比较广泛,深入研究EIAV与Viperin的相互作用,可为研究Viperin在慢病毒中的作用机制提供更多的资料。为明确马属Viperin对马传染性贫血病毒的作用及其机理,本文克隆了马的Viperin基因,并与人,恒河猴,小鼠以及猪的基因进行了同源性比对。结果发现,Viperin基因的N端70个氨基酸是高变区,包含了疏水的α螺旋,但是其中的几个亮氨酸位点却高度保守,表明这些保守的亮氨酸位点对于疏水的a螺旋区域的功能可能具有重要作用。同时,SAM区域的S1基序（CxxxCxxC）含3个半胱氨酸,在已有报道的几个物种中也是高度保守的。因此,为探明马Viperin与EIAV相互作用的具体机制,以及与其他物种或病毒的区别,本文设计三个步骤进行实验验证：首先,我们想明确EIAV的感染是否会影响到Viperin基因的表达。本文采用定量PCR的方法,发现EIAV病毒感染之后,Viperin的表达在24小时以及96小时出现两个小高峰,在96小时的时候,接毒组是对照组的2.8倍,因此EIAV的感染可以上调Viperin的表达。其次,明确Viperin基因的表达是否会影响EIAV的感染。由于马的巨噬细胞转染效率较低,本实验通过腺病毒载体将Viperin基因导入马巨噬细胞,然后接种病毒,检测EIAV病毒感染后48小时与72小时的病毒产量。结果表明,在72小时的时候,过表达Viperin的巨噬细胞的产毒量与对照组相比下降了将近一半（P<0.05）。同时,我们通过基因敲除（Knockdown）技术对巨噬细胞的Viperin基因进行干扰。结果表明,与对照组相比,下调Viperin基因的表达,可以促进EIAV病毒的产量（P<0.05）。最后,明确Viperin抑制病毒复制的机理。本文将Viperin基因与EIAV的感染性克隆共同转染293T细胞,48小时后检测细胞与上清中EIAV的病毒含量。结果表明,在细胞内的Gag蛋白的表达并没受到影响,但是细胞外的Gag含量随着Viperin的增加而减少,初步表明Viperin抑制了病毒的出芽。为进一步明确这种抑制病毒的出芽是否主要是抑制了EIAV Gag的出芽,我们用密码子优化过的Gag质粒与Viperin基因共转染,表明细胞内的Gag蛋白表达没有变化,但是上清中的Gag表达随着Viperin的增多而减少。进一步说明Viperin抑制EIAV的机制之一就是抑制Gag的出芽。为了明确Viperin抑制Gag的出芽是否是通过两种蛋白之间的相互作用完成的,本研究利用激光共聚焦实验进行验证。通过标签抗体的检测,发现两种蛋白可以发生很好的共定位。为进一步确定抑制Gag出芽的关键结构域,本文构建了各个结构域缺失的变异体。结果表明,α-helix和SAM区域对于阻碍Gag的出芽必不可少。但是三种变异体与Gag的共定位并未发生变化。我们推测两者之间的共定位对于阻碍病毒出芽是必要的,但不是关键原因。其中SAM区域对于阻碍病毒出芽更为重要,有研究表明,含有3个半胱氨酸的基序（CxxxCxxC）的变异可以增加丙型肝炎病毒,西尼罗病毒以及登革热病毒的感染性。因此,本文将SAM区域的3个半胱氨酸进行了突变。结果表明,突变其中1个半胱氨酸或者3个半胱氨酸同时突变,依然可以抑制EIAV感染,表明该基序并不是阻碍病毒出芽的关键位点,且与Viperin抑制丙型肝炎病毒感染的机制不同。而人Viperin的SAM区域所含前三个基序S1,S2,S3对于抑制HIV-1的复制是必须的。通过构建相应的变异体,S1的变异并未改变Viperin阻碍Gag出芽的功能。S2的突变可以稍稍减弱其抗病毒功能,S3的变异则彻底破坏了Viperin抑制Gag出芽的功能。S1与S2的联合突变可以破坏Viperin抗Gag出芽的能力。有趣的是,在HIV-1的研究中,S1+S2+S3的突变会影响人Viperin与HIV-1Gag的共定位,而马的Viperin S1+S2+S3变异后,仍然可以保持与EIAV的Gag共定位。Viperin与HIV-1的研究中,只说明了Viperin限制Gag的出芽,对于其他蛋白的影响并没有相关的研究报道。Gag和蛋白（Env）都是HIV-1与EIAV的主要结构蛋白,两种蛋白都与病毒的成熟,出芽有关。Viperin可以抑制Gag的出芽,那么Viperin是否会影响EIAV的Env的出芽呢?EIAV gp140是表面膜蛋白gp90和跨膜蛋白gp45的前体。本文用表达gp140的真核表达质粒与Viperin共同转染293T细胞,结果表明,细胞内Env的表达量随着Viperin的增加而减少。进一步通过构建变异体,我们发现Viperin N末端的α-helix结构域是抑制Env的表达关键,与其他两个结构域无关。因此表明Viperin抑制Env表达的机制与抑制Gag出芽的机制是不同的。另外,EIAV的调节蛋白Tat和Rev是调节EIAV基因表达的非结构蛋白,本文对Viperin是否抑制上述非结构蛋白的表达也进行了研究。通过Tat和Rev的真核表达质粒pEIAV-Tat, pEIAV-Rev与Viperin的表达质粒peViperin分别共转染293T细胞,结果表明Viperin的表达并不能影响非结构蛋白Tat和Rev的表达。因此推断Viperin抑制Env的表达可能是特异性的。为了证明,本文利用半定量PCR的方法,发现Viperin的过表达并不能影响Env的RNA水平。故进一步推测,其作用机制可能是Env蛋白合成后,通过泛素蛋白酶体途径或者溶酶体途径降解了。因此,本文加入了上述两个途径的抑制剂,MG132和氯喹。结果表明,两种抑制剂均对Viperin抑制Env的表达无影响。证明Viperin并不是通过这两种途径抑制Env的表达的。当我们用激光共聚焦观察转染细胞的时候,发现转染Viperin以及变异体（α-helix缺失变异体除外）可以在细胞内看到明显的囊泡状结构。α-helix缺失后则不能看到囊泡的产生。这就表明Viperin可能通过破坏细胞内的囊膜系统而抑制蛋白的表达。我们接着通过电镜观察,进一步证实转染含有α-helix区域的质粒,在细胞内均可以破坏内质网的结构,使内质网变为小泡结构,这些小泡聚集成大的泡状结构。有研究表明,EIAV的受体是ELRl,单独ELR1就可以介导EIAV的进入。前期研究结果表明,Viperin可以通过影响Gag的出芽以及囊膜蛋白Env的表达,Viperin是否会阻碍病毒的进入呢?本文通过慢病毒的方法构建含有ELR1的293T细胞系,通过含有荧光素酶报告基因的EIAV伪病毒来评价Viperin对病毒进入的影响。同时用恒河猴的（rh）TRIM5a作为阳性对照。通过转染HEK293T/ELR1细胞系,24小时之后接种EIAV伪病毒,接种之后24小时裂解细胞检测荧光素酶活性,表明转染Viperin的组可以显着抑制EIAV的进入（P<0.05）。同时,Viperin关键结构域中抑制病毒进入与抑制囊膜表达的结构域相同,都是α-helix结构域起关键作用。由于EIAV的Env与ELR表达都是通过内质网系统表达的,故而Viperin是否通过抑制ELR1的表达来实现抑制病毒的进入?本文将Viperin与ELR1的真核表达质粒共转染293T细胞,转染48小时之后,Western-blot检测结果表明,Viperin的表达可以抑制ELR1的表达,与预期相符。为进一步证实猜测,本文用VSVG包装的含有荧光素酶报告系统的EIAV伪病毒感染细胞,同时做了恒河猴rhTRIM5α的阳性对照。由于VSVG病毒的进入不需要细胞表面受体,发现Viperin阻碍伪病毒进入细胞的能力减弱了（P>0.05）；与此同时,恒河猴rhTRIM5a仍可以显着抑制病毒的进入（P<0.05）,进一步验证Viperin是通过抑制ELR1的表达来实现抑制病毒的进入。蛋白质的合成途径主要有两种,细胞质合成途径与内质网合成途径,这两种途径合成方式主要与蛋白的定位有关。EIAV病毒的Gag,Tat,Rev蛋白的合成主要在细胞质中,所以其细胞内的表达未受到影响。但是对于EIAV的囊膜蛋白,EIAV的受体ELR1蛋白而言,它们需要定位在细胞膜上,所以合成途径要经过内质网来合成。在Viperin与流感病毒,HIV-1,HCMV的相互作用中,Viperin可以抑制这些病毒的复制,但并不排除通过下调这些病毒的表面膜蛋白以及在细胞上的相应受体来实现抑制病毒的。例如,HCMV的表面糖蛋白gB就能被下调。疏水的α-helix结构域是抑制病毒囊膜蛋白以及EIAV受体蛋白表达的关键区域,并能引起内质网结构上的变化。但这种变化是如何形成的,是通过调节细胞骨架系统还是别的机制仍有待进一步的深入研究。病毒为了能够存活下来,已经进化出多种多样的机制来对抗宿主编码的限制因子,例如,对于抑制人免疫缺陷病病毒的天然免疫限制因子胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G而言,HIV-1的Vif蛋白可以通过泛素蛋白酶体途径进行将胞嘧啶脱氨酶降解,HIV-2的Vpx也可以通过泛素蛋白酶体途径降解SAMHD1,从而对抗SAMHD1对HIV-2复制的影响。Vpu可以通过改变Tetherin的分布来对抗Tetherin的限制。这使我们想到,EIAV是否也会进化出相应机制来对抗Viperin的限制呢?我们将Viperin与EIAV感染性克隆以及构建感染性克隆的空质粒对照进行共转染293T细胞。通过Western-blot技术检测细胞内蛋白含量。结果表明,在蛋白表达的水平上,EIAV并不能对Viperin的表达有影响,也不能降解Viperin,更不能像其它病毒能够产生一些效应蛋白降解抗病毒分子。咎其原因,可能是EIAV诱导的Viperin表达上调了2.8倍。但这也可能不足以完全的抑制病毒的复制,例如内源性的Viperin也可能不足以诱导内质网的病变。另一种可能就是,EIAV可能通过其他方式来对抗Viperin,而不是将其降解的途径来实现的。综上所述,马的Viperin是抑制马传染性贫血病毒的天然免疫限制因子。本文的研究有助于加深对Viperin抗病毒作用机理的认识,更扩大了Viperin的抗病毒谱范围。本文研究结果表明,Viperin抑制EIAV的复制是全方位的。首先,Viperin具有抑制EIAVGag出芽的功能,主要与α-helix和SAM结构域相关。而且,SAM结构域抑制Gag出芽的关键位点与人Viperin抑制HIV-1Gag出芽的机制不同。其次,Viperin的过表达可以抑制EIAV病毒囊膜基因以及EIAV受体的表达。主要作用机制是通过Viperin N末端疏水的α-helix结构域,破坏内质网的正常结构来抑制囊膜蛋白的表达降低病毒的产量,抑制EIAV受体的表达进而抑制病毒的进入。
李建波[9]（2013）在《对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究》文中提出对虾白斑综合症病毒（WSSV）隶属于线形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒属（Whispovirus）,是一种无包涵体、具双层囊膜、杆状型的双链环状DNA病毒。该病毒宿主范围很广,对虾、螯虾、蟹类等甲壳类都会被其侵染,而且传染力强,致死率高,难防治,不仅严重危害对虾养殖,还会对水生态环境构成威胁。病毒结构蛋白不仅有保护其遗传物质的功能,而且在感染过程中起决定性作用。本文围绕着WSSV结构蛋白开展研究。此外,还对其极早期基因开展了RNAi实验。具体内容主要包括了以下3个方面：（1）VP12是由病毒基因wsv009编码的一个低丰度蛋白。在本实验室早期的研究中,发现VP12存在于病毒的膜蛋白部分。为了进一步证实此结果,本文对该蛋白进行了原核表达,制备了VP12的多克隆抗体。利用此抗体进行Western blot和免疫电镜分析,结果证实VP12的确存在于膜蛋白部分中,并且推测其可能位于囊膜的内侧。利用CO-IP实验和Far-western blotting的方法,我们首先确认了膜蛋白复合体VP12/VP150的存在,继而,证明该复合体通过VP12与病毒衣壳蛋白VP51的相互作用结合在核衣壳上。上述结果进一步证明VP12存在于WSSV囊膜内侧,另一方面说明VP12在病毒的包装过程中可能起到连接蛋白的作用,将病毒的囊膜和核衣壳联系起来。进一步的研究表明VP12能和连接蛋白VP26相互作用。基于VP12可以通过分子间形成二硫键实现自身聚合的实验结果,我们推测VP12可能通过其与自身以及与VP26的相互作用起到稳定完整病毒粒子的作用。（2）由于病毒结构蛋白的相互作用是以立体交叉的网络形式存在,因此在第一部分的基础上,我们尝试寻找与VP150相互作用的蛋白。通过CO-IP分析,我们发现VP150可以和WSSV的主要结构蛋白之一的VP28相互作用,其作用位点存在于VP150的N端第1-206个氨基酸之间。Far-western blotting分析表明,在天然状态下,VP28的确能和全长的VP150相互作用,推测VP150可能从其N端开始降解。结合第一部分的结果,我们可以得出结论复合体VP12/VP150通过与VP28的相互作用结合在更大的膜蛋白复合体上,这样就形成了一个横跨囊膜和核衣壳的立体网络结构。（3）利用RNA干扰技术,对wsv051等7个极WSSV早期基因进行了基因沉默实验。结果表明wsv051和wsv083对应的dsRNA抑制相应的基因的转录效果最好。实时荧光定量PCR结果显示,与阴性组或阳性组相比,基因特异的dsRNA具有较强的抑制WSSV增殖的作用（P<0.05）。这些结果表明用RNA干扰的方法研究WSSV的极早期基因功能的思路是可行的,也为进一步研究WSSV极早期基因的功能提供了新的思路。综上所述,本文通过对于WSSV病毒的结构蛋白VP12和VP150的性质以及与它们相互作用的其它蛋白的研究,以及极早期基因RNA干扰的研究,为进一步了解病毒的入侵、包装、成熟以及释放提供了重要基础知识,为病毒的防治提供有效科学的依据。
李珊[10]（2013）在《人类内源性逆转录病毒W家族env基因在神经细胞中过表达致KCNN3通道开放及TLR通路活化机制研究》文中研究说明目的：HERV可能会导致精神分裂症的发生发展。在本研究中,运用分子生物学和电生理的方法,我们将探讨HERV-W env基因在精神分裂症发病机制中的作用。方法：荧光显微镜观察ENV蛋白在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中的细胞定位。在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和IMR32中过表达env基因,运用半定量RT-PCR和Real-time PCR检测小电导钙激活钾通道超家族N成员3（small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member3, KCNN3）和S100钙结合蛋白B （S100calcium-binding protein B, S100B） mRNA表达水平；运用Western-blot检测KCNN3基因蛋白表达水平：使用萤光素酶系统检测目的基因启动子活性；通过基因干扰实验分别下调cAMP反应原件结合蛋白（cAMP-response element-binding protein, CREB）的表达,以证明CREB在env激活基因表达中的作用；运用全细胞膜片钳技术记录KCNN3通道电流；钙离子结合染料Fluo-3/AM用于标记细胞内钙离子,流式细胞术检测胞内钙离子浓度。荧光显微镜观察ENV蛋白在人神经胶质母细胞瘤细胞系A172中的细胞定位。在人神经胶质母细胞瘤细胞系A172和U251中过表达env基因,运用RT-PCR检测TLR通路上多个基因的mRNA表达水平。结果：在SH-SY5Y中,ENV蛋白定位于细胞膜上。过表达env基因将导致SH-SY5Y和IMR-32细胞内KCNN3基因在mRNA、蛋白表达水平上的上调而且这一现象也出现于EGTA处理组中；env致KCNN3基因表达上调的作用主要是由env的胞外片段引起的；env能够通过CRE位点上调基因启动子的活性和下游基因的表达；在电生理膜片钳实验中,我们检测到env能够通过CREB上调钾通道电流的强度,并且这一增强的钾电流能够被SK通道的抑制剂ScyTX所抑制；后续的实验表明env能够使细胞内的游离钙离子浓度以及钙结合蛋白S100B明显升高。在A172中,ENV蛋白定位于细胞质中。env基冈的过表达将导致A172和U251细胞中TLR通路相关基因在mRNA水平上的上调,标志着TLR通路的活化和大量细胞因子的释放。结论：我们的研究结果首次揭示了env能够导致钙依赖性钾通道开放、钙离了浓度和钙结合蛋白表达上调和TLR信号通路的活化。我们的研究将为env在精神分裂症发病机制上的作用提供新的思路,并且可能为中枢系统慢性疾病或神经退行型疾病的诊断和治疗奠定基础。
二、EB病毒相关疾病的病毒表达和人dUTP酶（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EB病毒相关疾病的病毒表达和人dUTP酶（论文提纲范文）
（1）非洲猪瘟病毒L7L-L11L基因功能鉴定及疫苗候选株研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 非洲猪瘟概述 |
| 1.1.1 非洲猪瘟流行及危害 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒 |
| 1.2 非洲猪瘟病毒编码蛋白研究进展 |
| 1.3 非洲猪瘟基因缺失疫苗及候选基因研究进展 |
| 1.3.1 AMGF毒株 |
| 1.3.2 ATK毒株(A240L) |
| 1.3.3 AB119L毒株 |
| 1.3.4 ACD2v毒株(EP402R) |
| 1.3.5 ADP71L毒株 |
| 1.3.6 AUK毒株(DP96R) |
| 1.3.7 其他基因 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 非洲猪瘟病毒序列分析及L7L-L11L基因缺失病毒的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 L7L-L11L在不同毒株间保守性 |
| 2.3.2 猪原代巨噬细胞的制备 |
| 2.3.3 同源重组质粒pAL7L-L11L EGFP的构建 |
| 2.3.4 ASFV基因缺失病毒SY18AL7-11的构建 |
| 2.3.5 SY18AL7-11的体外生物学特性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 非洲猪瘟L7L-L11L基因缺失病毒在猪体内的特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SY18ΔL7-11对猪的致病力 |
| 3.3.2 SY18ΔL7-11接种猪对强毒攻击的保护 |
| 3.3.3 机体对ASFV SY18及SY18ΔL7-11的免疫应答 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 L7L-L11L基因片段中ASFV毒力相关基因鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 同源重组质粒的构建 |
| 4.3.2 L7L L11L单基因缺失病毒的构建 |
| 4.3.3 L7L-L11L单基因缺失病毒在体外巨噬细胞的生长曲线 |
| 4.3.4 L7L-L11L单基因缺失病毒对猪的致病力 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于L7L-L11L缺失株的ASF疫苗候选株构建及免疫试验 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 SY18ΔL7-11ΔCD2v及SY18ΔL7-11ΔMGF的构建 |
| 5.3.2 SY18ΔL7-11ΔCD2v及SY18ΔL7-11ΔMGF的体外增殖特性 |
| 5.3.3 SY18ΔL7-11ΔCD2v及SY18ΔL7-11ΔMGF的安全性 |
| 5.3.4 SY18ΔL7-11ΔCD2v及SY18ΔL7-11ΔMGF的免疫保护性 |
| 5.3.5 抗体水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的研制及间接ELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 非洲猪瘟病原学 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒的结构 |
| 1.2 非洲猪瘟病毒的基因组结构 |
| 1.3 非洲猪瘟病毒的理化性质 |
| 1.4 非洲猪瘟病毒的感染机制 |
| 2 非洲猪瘟的流行病学及临床表现 |
| 2.1 传染源 |
| 2.2 传播途径 |
| 2.3 易感动物 |
| 2.4 非洲猪瘟的临床表现 |
| 3 非洲猪瘟的实验室诊断 |
| 3.1 非洲猪瘟的病原学检测 |
| 3.2 非洲猪瘟的血清学检测 |
| 4 ASFV疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 基因工程疫苗 |
| 4.3 减毒活疫苗 |
| 5 非洲猪瘟病毒p30蛋白 |
| 5.1 p30蛋白的结构 |
| 5.2 p30介导ASFV中和抗体的研究 |
| 5.3 p30在非洲猪瘟检测上的研究 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 研究内容一 非洲猪瘟病毒p30基因的克隆及表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌体、细胞及载体来源 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 非洲猪瘟病毒p30基因的扩增 |
| 2.2 真核表达载体pcDNA3.1-p30的构建和鉴定 |
| 2.3 原核重组蛋白p30-his的表达和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的纯化和鉴定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 非洲猪瘟p30基因的扩增 |
| 3.2 真核表达质粒pcDNA3.1-p30的酶切鉴定 |
| 3.3 真核表达质粒pcDNA3.1-p30的IFA鉴定 |
| 3.4 真核表达质粒pcDNA3.1-p30的Western Blot鉴定 |
| 3.5 原核表达质粒p30-his的酶切鉴定 |
| 3.6 原核重组蛋白的诱导表达 |
| 3.7 IPTG诱导浓度的优化 |
| 3.8 原核重组蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.9 原核重组蛋白的纯化 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的研制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1细胞及实验动物来源 |
| 1.2 主要材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫原的准备 |
| 2.2 动物免疫程序 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.5 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.6 单克隆抗体的Western Blot分析 |
| 2.7 单克隆抗体与病毒的反应性及中和活性分析 |
| 2.8 单克隆抗体的交叉反应性分析 |
| 2.9 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 2.10 单克隆抗体腹水的制备 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清的IFA分析 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 3.3 单克隆抗体的Western Blot分析 |
| 3.4 单克隆抗体与病毒的反应性结果 |
| 3.5 单克隆抗体中和活性分析结果 |
| 3.6 单克隆抗体的交叉反应性分析 |
| 3.7 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.8 单克隆抗体腹水的IFA测定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 包被抗原和血清 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度 |
| 2.2 最佳封闭液及封闭时间 |
| 2.3 最佳一抗作用时间 |
| 2.4 最佳二抗作用时间 |
| 2.5 探索最佳显色时间 |
| 2.6 确定间接ELISA方法临界值 |
| 2.7 特异性实验 |
| 2.8 间接ELISA方法重复性实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 最佳抗原包被浓度和最佳待检血清稀释度的确定 |
| 3.2 最佳封闭液和封闭时间的确定 |
| 3.3 最佳一抗作用时间的确定 |
| 3.4 最佳二抗作用时间的确定 |
| 3.5 最佳显色时间的确定 |
| 3.6 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 3.7 间接ELISA方法特异性实验结果 |
| 3.8 间接ELISA方法重复性实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）山羊关节炎脑炎病毒编码蛋白逃逸先天性免疫的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 CAEV概述 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 分子生物学研究 |
| 1.1.3 生物学周期简述 |
| 1.1.4 致病机理 |
| 1.1.5 流行病学特点及临床特征 |
| 1.1.6 诊断与防治 |
| 1.2 CAEV感染的免疫反应 |
| 1.2.1 CAEV引起的先天免疫应答 |
| 1.2.2 CAEV引起的适应性免疫应答 |
| 1.3 I型 IFN概述 |
| 1.3.1 产生IFN-β信号通路介绍 |
| 1.3.2 I型 IFN信号传导和ISG的诱导 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 不同CAEV蛋白对IFN-β产生的调节作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因克隆 |
| 2.3.2 载体构建及验证 |
| 2.3.3 细胞转染及接毒(以12孔板为例) |
| 2.3.4 真核载体表达验证 |
| 2.3.5 总RNA提取及cDNA合成 |
| 2.3.6 相对荧光定量PCR检测 |
| 2.3.7 荧光素酶活性检测 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 CAEV基因扩增 |
| 2.4.2 真核表达载体构建及验证 |
| 2.4.3 过表达病毒蛋白对SeV复制的影响 |
| 2.4.4 病毒蛋白对IFN-β的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 CAEV蛋白对SeV增殖的影响 |
| 2.5.2 CAEV蛋白对IFN-β的影响 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 DU影响IFN-β产生的分子机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基因克隆 |
| 3.3.2 载体构建及验证 |
| 3.3.3 相对荧光定量PCR检测 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 DU对 IFN-β的抑制作用不受标签蛋白的影响 |
| 3.4.2 DU促进SeV和 VSV复制 |
| 3.4.3 DU剂量依赖性的抑制IFN-β的表达 |
| 3.4.4 DU在 IFN-β产生的信号通路上的作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 CAEV蛋白Vif对 IFN-β转录表达的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用细胞、病毒、菌株与载体 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基因克隆 |
| 4.3.2 载体构建及验证 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 Vif抑制IFN-β信号通路 |
| 4.4.2 Vif抑制的信号通路中位于IRF3上游的信号分子 |
| 4.4.3 Vif中有关键结构域影响其抑制IFN-β的功能 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（5）HSV-1突变毒株的构建及其生物学特性和免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| HSV-1简介 |
| HSV-1的基因组结构及编码特点 |
| HSV-1的流行病学分析 |
| HSV-1的致病特点和致病机制 |
| 原发感染 |
| 潜伏感染 |
| 复发感染 |
| HSV-1疫苗的研究进展 |
| HSV-1重组病毒的构建 |
| 温度敏感突变,标记拯救和同源重组技术 |
| 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)和Red/ET重组系统 |
| CRISPR/Cas9系统 |
| 实验思路 |
| 第一部分 HSV-1突变毒株M1的构建及衣被蛋白UL7在病毒增殖过程中的功能分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 工程菌 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.1.4 实验用动物 |
| 1.1.5 质粒与载体 |
| 1.1.6 抗体 |
| 1.1.7 试剂和商品化溶液 |
| 1.1.8 引物 |
| 1.1.9 主要溶液及配制 |
| 1.1.10 主要耗材 |
| 1.1.11 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 病毒培养 |
| 1.2.3 质粒构建 |
| 1.2.4 质粒提取及质粒转染 |
| 1.2.5 HSV-1突变毒株的构建和纯化 |
| 1.2.6 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的制备 |
| 1.2.7 突变病毒M1及其补偿病毒在细胞水平的生物学特性分析 |
| 1.2.8 突变毒株M1及其补偿病毒在小鼠的致病性分析 |
| 1.2.9 HSV-1编码的UL7蛋白对即刻早期基因α-4的转录调控作用分析 |
| 1.2.10 统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M1的构建 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas9系统造成HSV-1 u17基因突变的检测 |
| 2.1.2 HSV-1突变毒株M1的分离纯化 |
| 2.2 突变毒株M1的生物学特性分析 |
| 2.2.1 突变毒株M1在Vero细胞上的增殖动力学分析 |
| 2.2.2 突变毒株M1在Vero细胞上的蚀斑形态分析 |
| 2.3 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的生物学特性分析 |
| 2.3.1 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的制备 |
| 2.3.2 突变毒株M1的补偿病毒在Vero细胞上的增殖动力学分析 |
| 2.3.3 突变毒株M1的补偿病毒在Vero细胞上的蚀斑形态分析 |
| 2.4 突变毒株M1在小鼠的致病性分析 |
| 2.4.1 突变病毒M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期临床表现分析 |
| 2.4.2 突变毒株M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期组织病理和免疫组织化学分析 |
| 2.4.3 突变病毒M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期器官组织中病毒载量分 |
| 2.4.4 HSV-1野生型毒株与突变毒株M1感染小鼠后潜伏感染期神经组织中病毒载量和LAT基因的表达水平分析 |
| 2.5 HSV-1编码的UL7蛋白在病毒增殖复制中的作用分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 HSV-1突变毒株M2和M3的构建及其生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 本部分实验所用工程菌、病毒、细胞系、细胞培养用溶液、实验动物、质粒与载体、抗体、商品化试剂和溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.1.4 试剂和商品化溶液 |
| 1.1.5 引物 |
| 1.1.6 原位杂交实验相关溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本部分实验所用细胞培养、病毒培养、质粒构建、质粒提取及质粒转染、HSV-1突变毒株的构建和纯化、突变毒株在细胞水平的生物学特性分析和动物水平的致病性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.2.2 病毒突变率检测(对得到的P1、P2病毒进行检测) |
| 1.2.3 原位杂交 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M2和M3的构建 |
| 2.1.1 突变毒株M2和M3中ul7,ul41和LAT基因的修饰突变及鉴定 |
| 2.2 突变毒株M1、M2和M3在细胞水平的生物学特性分析 |
| 2.3 突变毒株M1、M2和M3在小鼠的致病性分析 |
| 2.3.1 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期临床表现分析 |
| 2.3.2 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期组织病理和免疫组织化学分析 |
| 2.3.3 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期器官组织中的病毒载量分析 |
| 2.3.4 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后潜伏感染期三叉神经节中病毒载量和相关基因表达水平分析 |
| 2.3.5 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后潜伏感染期三叉神经节中针对LAT基因的原位杂交分析 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 HSV-1突变毒株M3的免疫原性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 本部分实验所用病毒、细胞系、细胞培养用溶液、实验动物、抗体、商品化试剂和溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.1.2 病毒 |
| 1.1.3 试剂和商品化溶液 |
| 1.1.4 引物及肽段 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 本部分实验所用细胞培养、病毒培养、病毒感染后动物水平的致病性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 小鼠免疫血清制备 |
| 1.2.4 小鼠脾淋巴细胞的分离 |
| 1.2.5 抗血清中和实验 |
| 1.2.6 IFN-γ Elispot检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M3的免疫原性分析 |
| 2.1.1 突变毒株M3在小鼠体内诱导的免疫反应分析 |
| 2.1.2 突变毒株M3在小鼠体内的免疫保护效率分析 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 基因编辑技术在衣被蛋白研究中的意义 |
| 引言 |
| 衣被蛋白研究的早期 |
| 衣被蛋白研究的发展阶段 |
| 病毒基因转录调控因子 |
| 病毒基因组复制相关蛋白-UTPase |
| 胸苷激酶TK |
| 病毒毒力相关蛋白 |
| 病毒转运及成熟相关蛋白 |
| 衣被蛋白研究的崭新阶段 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 论文中突变毒株的基因片段 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生个人简历 |
（6）马传染性贫血病毒在马基因组上整合特征的分析（论文提纲范文）
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 EIAV生物学特征 |
| 1.1.1 EIAV的首次发现 |
| 1.1.2 EIAV基因组构成 |
| 1.1.3 EIAV致病性 |
| 1.1.4 EIAV细胞嗜性 |
| 1.2 中国EIAV弱毒疫苗株的致弱路线 |
| 1.3 逆转录病毒的生活周期 |
| 1.3.1 逆转录病毒生活周期中的早期阶段 |
| 1.3.2 整合酶在病毒生活周期中的重要性 |
| 1.4 整合酶结构 |
| 1.4.1 N末端区域 |
| 1.4.2 催化核心 |
| 1.4.3 C末端区域 |
| 1.5 整合机制 |
| 1.5.1 病毒DNA 3'-端的处理和链的转移反应 |
| 1.5.2 宿主基因组上病毒插入位点的缺.修复 |
| 1.6 整合前复合物 |
| 1.6.1 病毒蛋白 |
| 1.6.2 宿主细胞蛋白 |
| 1.7 逆转录病毒在宿主基因组水平上整合位点的选择特征 |
| 1.7.1 靶向整合的DNA序列及结构 |
| 1.7.2 基因组水平上的整合靶向研究 |
| 1.8 逆转录病毒整合位点选择特征差异的机制 |
| 1.8.1 LEDGF/p75决定着HIV-1 的靶向整合 |
| 1.8.2 BET蛋白决定着MLV的靶向整合 |
| 1.9 逆转录病毒在基因组上发生整合的后果 |
| 1.9.1 潜伏（以HIV-1 感染为例） |
| 1.9.2 插入突变 (以逆转录病毒基因治疗载体为例) |
| 1.10本研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 马单核细胞分化而来的巨噬细胞及马胎皮肤细胞的培养及感染 |
| 2.2.2 细胞DNA的小量提取 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 反转录及病毒载量测定 |
| 2.2.5 构建病毒整合文库 |
| 2.2.6 PCR扩增病毒整合文库 |
| 2.2.7 胶回收 |
| 2.2.8 TA克隆与细菌转化试验 |
| 2.2.9 阳性克隆的鉴定及测序 |
| 2.2.10序列分析 |
| 2.2.11统计学分析 |
| 2.2.12序列登录号 |
| 第三章 弱毒疫苗株EIAVFDDV13在马基因组上的整合定位及特征 |
| 3.1 EIAVFDDV13在马胎皮肤细胞中的生长曲线 |
| 3.2 该研究中所使用的整合位点数据集 |
| 3.3 EIAVFDDV13前病毒的染色体分布 |
| 3.4 EIAVFDDV13前病毒在基因内的整合频率 |
| 3.5 整合位点周围 40 BP范围内各位点的碱基频率 |
| 3.6 EIAVFDDV13前病毒整合靶向与基因组特征的相关性 |
| 3.7 EIAVFDDV13前病毒整合靶向与重复元素的相关性 |
| 3.8 整合有EIAVFDDV13前病毒宿主基因的GO分析 |
| 小结 |
| 第四章 弱毒疫苗株EIAVDLV121在马基因组上的整合定位及特征 |
| 4.1 EIAVDLV121在马巨噬细胞中的生长曲线 |
| 4.2 该研究中所使用的整合位点数据集 |
| 4.3 EIAVDLV121前病毒的染色体分布 |
| 4.4 EIAVDLV121前病毒在基因内的整合频率及比较 |
| 4.5 整合位点周围 40 BP范围内各位点的碱基频率 |
| 4.6 EIAVDLV121前病毒整合靶向与基因组特征的相关性 |
| 4.7 EIAVDLV121前病毒整合靶向与重复元素的相关性 |
| 4.8 整合有EIAVDLV121前病毒宿主基因的GO分析 |
| 小结 |
| 第五章 EIAVDLV34和EIAVDLV121在马基因组上整合位点选择特征比较 |
| 5.1 在马巨噬细胞中，EIAVDLV34和EIAVDLV121的生长曲线 |
| 5.2 该章所使用的数据集 |
| 5.3 EIAVDLV34和EIAVDLV121在马染色体上的分布 |
| 5.4 EIAVDLV34和EIAVDLV121前病毒在基因内的整合频率及比较 |
| 5.5 整合位点周围 40 BP范围内各位点的碱基频率 |
| 5.6 EIAVDLV34和EIAVDLV121前病毒整合靶向与基因组特征的相关性 |
| 5.7 EIAVDLV34和EIAVDLV121前病毒整合靶向与重复元素的相关性 |
| 5.8 整合有EIAV前病毒宿主基因的GO分析 |
| 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）JSRV囊膜蛋白及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化与分子发生机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 绵羊肺腺瘤概述 |
| 1.2 绵羊肺腺瘤的临床症状、病理学特征及流行情况 |
| 1.3 绵羊肺腺瘤的病原学 |
| 1.4 逆转录病毒性肿瘤 |
| 1.5 OPA的致瘤机制 |
| 1.6 非拼接逆转录病毒RNA的出核转运 |
| 1.7 OPA小型动物模型 |
| 1.8 基因突变与肿瘤发生的关系 |
| 1.9 研究的目的及意义 |
| 2 试验一 稳定表达JSRV受体绵羊Hyal-2蛋白细胞系的建立 |
| 摘要 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二 JSRV Env及其亚基诱导转化NIH 3T3细胞 |
| 摘要 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三 JSRV Env及其亚基对NIH 3T3细胞肿瘤相关基因突变的影响 |
| 摘要 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 试验四 JSRV前病毒基因组全长重组质粒pMD-JSRV的构建 |
| 摘要 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 总体结论和创新点 |
| 6.1 总体结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（8）马病毒抑制蛋白Viperin抑制马传染性贫血病毒复制的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 EIAV基本分子生物学特性 |
| 1.2 EIAV临床特征与生理病理学 |
| 1.3 中国EIAV弱毒疫苗及相关研究进展 |
| 1.4 EIAV弱毒疫苗研制的路线 |
| 1.5 EIAV的免疫控制 |
| 1.6 Viperin综述 |
| 1.7 Viperin表达模式 |
| 1.8 Viperin的生物学功能 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 菌株,质粒,细胞株和实验动物 |
| 2.3 引物合成 |
| 2.4 其他主要试剂盒 |
| 2.5 主要仪器与耗材 |
| 3 方法 |
| 3.1 常规分子克隆方法 |
| 3.2 重组蛋白的表达与相应的功能性验证 |
| 3.3 软件 |
| 3.4 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 Viperin抑制EIAV的复制 |
| 4.2 Viperin抑制EIAV Gag出芽 |
| 4.3 Viperin SAM区关键结构域定位 |
| 4.4 Viperin抑制EIAV Env的表达 |
| 4.5 Viperin抑制EIAV Env表达机制 |
| 4.6 Viperin抑制EIAV的进入 |
| 4.7 EIAV对Viperin无降解作用 |
| 5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| Contents |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 对虾白斑综合症病毒(WSSV)及其分子生物学研究现状 |
| 1.1 对虾白斑病简介 |
| 1.2 对虾白斑综合症病毒的研究概况 |
| 1.2.1 对虾白斑综合症病毒的命名、形态学特征及其分类学地位 |
| 1.2.2 对虾白斑综合症病毒的宿主和传播途径 |
| 1.2.3 对虾白斑综合症的症状、组织病理学分析以及感染动物模型 |
| 1.2.4 WSSV感染宿主的过程以及病毒的生活周期 |
| 1.3 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组学研究概况 |
| 1.3.1 WSSV全基因组序列的测定 |
| 1.3.2 对虾白斑综合症病毒基因组的转录和调控 |
| 1.3.3 WSSV极早期基因的研究概况 |
| 1.4 对虾白斑综合症病毒的蛋白质组学研究 |
| 1.4.1 对虾白斑综合症病毒的结构蛋白的研究 |
| 1.4.2 WSSV囊膜形成的方式和模型 |
| 1.4.3 对虾白斑综合症病毒的非结构蛋白的研究 |
| 2 蛋白质相互作用主要的研究技术 |
| 3 RNA干扰的研究概况 |
| 3.1 RNA干扰的发现及其作用机制 |
| 3.2 RNA干扰在对虾病毒研究中的应用 |
| 4 本论文的研究目的、内容和意义 |
| 第一部分：WSSV膜蛋白VP12的功能研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 WSSV完整病毒粒子以及膜蛋白和核衣壳蛋白的制备 |
| 2.2.2 基因的克隆表达和蛋白质的纯化 |
| 2.2.3 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.4 Western blotting分析 |
| 2.2.5 Far-Western分析 |
| 2.2.6 逆转录PCR |
| 2.2.7 VP12的免疫电镜定位 |
| 2.2.8 重组质粒的共转表达与Co-Immunoprecipitation分析 |
| 2.2.9 体外结合共沉淀 |
| 3 结果 |
| 3.1 wsv009结构分析 |
| 3.2 wsv009在感染过程中的转录时相分析 |
| 3.3 表达质粒pET-His-VP12的构建和鉴定 |
| 3.4 重组VP12蛋白的表达和纯化 |
| 3.5 Western blotting分析VP12蛋白在病毒粒子中的定位 |
| 3.6 VP12的免疫电镜定位 |
| 3.7 pET-V5-VP150N、pET-V5-VP150M和pET-V5-VP150C的构建 |
| 3.8 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP12之间的相互作用 |
| 3.9 VP12和衣壳的体外共沉淀实验 |
| 3.10 Far-Western blotting分析VP12与VP51的相互作用 |
| 3.11 Co-Immunoprecipitation分析验证VP12和VP51之间的相互作用 |
| 3.12 VP12的自身相互作用 |
| 3.13 Far-western blotting证明VP12与VP26的相互作用 |
| 3.14 Co-Immunoprecipitation分析验证VP12和VP26之间的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 WSSV膜蛋白VP150的功能研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 WSSV完整病毒粒子以及膜蛋白和核衣壳蛋白的制备 |
| 2.2.2 重组质粒表达以及可溶蛋白纯化 |
| 2.2.3 Western blotting分析 |
| 2.2.4 Far-Western分析 |
| 2.2.5 重组质粒的共转表达与Co-Immunoprecipitation分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP28之间的相互作用 |
| 3.2 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP24之间的相互作用 |
| 3.3 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP26之间的相互作用 |
| 3.4 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP19之间的相互作用 |
| 3.5 重组蛋白His-GST和His-VP28的表达和纯化 |
| 3.6 Far-Western blotting分析VP150与VP28的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 WSSV极早期基因的RNA干扰初步研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 WSSV完整病毒粒子的制备 |
| 2.2.2 dsRNA的体外合成 |
| 2.2.3 dsRNA体内注射 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 逆转录PCR |
| 3 结果 |
| 3.1 dsRNA的体外合成 |
| 3.2 实时荧光定量PCR分析dsRNA对WSSV增殖的抑制作用 |
| 3.3 逆转录PCR分析特异性dsRNA对病毒相应基因转录的抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 主要仪器设备 |
| 2 常用溶液及培养基的配制 |
| 3 常规实验方法 |
| 博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）人类内源性逆转录病毒W家族env基因在神经细胞中过表达致KCNN3通道开放及TLR通路活化机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分：人类内源性逆转录病毒W家族env在神经母细胞瘤细胞过量表达导致KCNN3通道开放以及胞内钙浓度升高 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：人类内源性逆转录病毒W家族env在神经胶质细胞瘤中的过量表达通过TLR途径引起部分细胞因子的升高 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 五、综述 |
| 主要参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
四、EB病毒相关疾病的病毒表达和人dUTP酶（论文参考文献）
- [1]非洲猪瘟病毒L7L-L11L基因功能鉴定及疫苗候选株研究[D]. 张静远. 宁夏大学, 2021(02)
- [2]非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的研制及间接ELISA抗体检测方法的建立[D]. 周小钰. 扬州大学, 2020
- [3]山羊关节炎脑炎病毒编码蛋白逃逸先天性免疫的分子机制[D]. 王家顺. 天津大学, 2018(07)
- [4]外泌体在病毒性疾病传播中的作用研究进展[J]. 李解珍,张声. 中华病理学杂志, 2018(03)
- [5]HSV-1突变毒株的构建及其生物学特性和免疫原性分析[D]. 徐兴丽. 北京协和医学院, 2017(11)
- [6]马传染性贫血病毒在马基因组上整合特征的分析[D]. 刘强. 中国农业科学院, 2015(01)
- [7]JSRV囊膜蛋白及其亚基诱导NIH 3T3细胞转化与分子发生机制的研究[D]. 刘畅. 内蒙古农业大学, 2014(01)
- [8]马病毒抑制蛋白Viperin抑制马传染性贫血病毒复制的机制[D]. 汤艳东. 南方医科大学, 2014(01)
- [9]对虾白斑综合症病毒（WSSV）膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究[D]. 李建波. 厦门大学, 2013(05)
- [10]人类内源性逆转录病毒W家族env基因在神经细胞中过表达致KCNN3通道开放及TLR通路活化机制研究[D]. 李珊. 武汉大学, 2013(07)